老年黃斑變性的動物模型研究進展

【摘要】老年黃斑變性（AMD）是導(dǎo)致65歲以上人群視力下降的主要原因之一，國內(nèi)外不少學(xué)者均致力于對AMD的研究。由于該病的復(fù)雜性，至今尚無滿意的治療方法，且臨床標本來源困難，成為AMD研究的瓶頸，因此，合適的動物模型對新療法的研究至關(guān)重要。本文對近年來用于AMD研究的動物模型進行綜述，通過對各模型的利弊分析，為選擇合適的動物模型進行AMD研究提供一定的幫助。

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4379（2015）01-0062-04

DOI：10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.01.019

作者單位：南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210000

通訊作者：魏偉，

E-mail：13951776603@163.com

Research progress of animal models for age-related macular degeneration

XU Zhuqing，WEI Wei. Nanjing University of Tra-

ditional Chinese Medicine，Nanjing 210000，China

【Abstract】Age-related macular degeneration（AMD）is the leading cause of vision loss of those over the age of 65.Scholars at home and abroad are dedicated to the study of AMD. Because of the complexity of the disease，there are no satisfactory therapies. Accurate animal models of the disease could assist greatly in the development of new therapies. This article reviewed different experimental animal models of AMD used in recent studies．

【Key words】animal model; age-related macular degeneration

老年黃斑變性是一種隨年齡增長而發(fā)病率逐漸上升的黃斑疾病。在中國，65歲以上人群AMD的患病率超過10% 〔1〕。AMD病理改變?yōu)辄S斑區(qū)的光感受器、視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）、Bruch膜以及脈絡(luò)膜毛細血管隨著年齡增長而發(fā)生的一系列改變，其標志性臨床表現(xiàn)為玻璃膜疣的出現(xiàn) 〔2〕。臨床上將AMD分為萎縮型（干性）與滲出型（濕性）兩大類。滲出型AMD主要特點是有脈絡(luò)膜新生血管（CNV）的形成。雖然目前治療本病的手段多樣，但存在療效不確定、對眼組織造成損傷、治療周期長、費用昂貴等缺點，且沒有從根本上解決疾病對視力的影響，因此，合適的動物模型對新療法的研究至關(guān)重要。

1　直接誘導(dǎo)的CNV動物模型

CNV是濕性AMD視力減退的主要原因，對其治療亦多致力于消除CNV，因此AMD的相關(guān)研究多選擇直接誘導(dǎo)的CNV動物模型。

1.1激光誘導(dǎo)的CNV模型

該模型在目前AMD的相關(guān)研究中很常用。其主要機制為通過激光選擇性的破壞光感受器外節(jié)、RPE細胞、Bruch膜和脈絡(luò)膜毛細血管，引起一系列損傷修復(fù)反應(yīng)，繼而形成新生血管。該方式誘導(dǎo)CNV發(fā)生率可高達70%，形成的新生血管復(fù)合物主要包括成纖維細胞、RPE細胞和血管內(nèi)皮細胞，早期尚有少量炎細胞聚集，如中性粒細胞和巨噬細胞等 〔3〕。激光誘導(dǎo)CNV動物模型雖與人類CNV疾病有很多共同之處，但是該方式伴有視網(wǎng)膜的損傷,而在人類CNV形成中是不存在的。另外,其引起B(yǎng)ruch膜破裂的原因與人類CNV也有所不同。激光誘導(dǎo)CNV在大小鼠、豬、兔、猴等動物身上都有成功造模實驗，目前常用的激光有氪、氬、二極管等，不同激光誘導(dǎo)CNV時要注意激光的波長、光斑、輸出能量、曝光時間等，這些因素對模型建造的成功率都有一定的影響 〔4〕。

1.2堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)誘導(dǎo)的CNV模型

在兔視網(wǎng)膜下注射bFGF凝膠微粒誘導(dǎo)的CNV，發(fā)生率

高達83%，熒光滲漏可持續(xù)2~6周，具有重復(fù)性高、經(jīng)濟、操作簡單等優(yōu)點，且無視網(wǎng)膜下積液形成。然而此模型沒有基底膜沉淀物、玻璃膜疣、RPE脫離和視網(wǎng)膜下出血等人類CNV的表現(xiàn)，且bFGF不穩(wěn)定，體內(nèi)半衰期短。近年來研究發(fā)現(xiàn)，bFGF不是CNV生成所必需的，體內(nèi)的表達水平也不足以誘導(dǎo)CNV的發(fā)生 〔5〕。

1.3血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）誘導(dǎo)的CNV模型

在猴眼內(nèi)注射載有VEGF基因的腺相關(guān)病毒（AAV-VEGF）后第5周可誘導(dǎo)出CNV,并持續(xù)表達20個月，4周時CNV的生成率最高，可達95%。玻璃體內(nèi)注射AAV-VEGF會出現(xiàn)虹膜新生血管,視網(wǎng)膜下注射則僅在注射區(qū)域出現(xiàn)CNV。免疫組化結(jié)果顯示玻璃體內(nèi)注射較視網(wǎng)膜下注射后眼內(nèi)液中VEGF表達量高。玻璃體內(nèi)注射低劑量AAV-VEGF不會影響視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層及脈絡(luò)膜,高濃度可誘導(dǎo)出視網(wǎng)膜新生血管。而視網(wǎng)膜下注射低濃度AAV-VEGF則會出現(xiàn)CNV和黃斑囊樣水腫（CME），高濃度也可誘導(dǎo)出視網(wǎng)膜新生血管，由此可見VEGF注射部位、作用的靶細胞及彌散程度均會對CNV的形成有影響 〔6〕。另有實驗證明在猴視網(wǎng)膜下注射重組人VEGF凝膠微粒,可產(chǎn)生累及黃斑的局限性視網(wǎng)膜脫離。2~8周可觀察到CNV的形成，且發(fā)生率高達95%。但模型不存在AMD相應(yīng)視網(wǎng)膜變性，Bruch膜也無沉積物形成 〔7〕。

1.4視網(wǎng)膜下注射自體玻璃體誘導(dǎo)的CNV模型

將兔自身玻璃體注射入其視網(wǎng)膜下，不造成玻璃膜的損壞，在4~40周內(nèi)視網(wǎng)膜下新生血管（SRN）的發(fā)生率為33%~ 57%，引起視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜下細胞增生及CNV生成。由于Bruch膜沒有受到機械性損傷，形成的SRN在FFA下未觀察到熒光素滲漏。通過組織學(xué)切片見到新生血管具有脈絡(luò)膜毛細血管的特征，SRN可穿過Bruch膜進入視網(wǎng)膜下腔，視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層發(fā)生變性，神經(jīng)膠質(zhì)細胞和RPE細胞增生，該模型是一種不造成玻璃膜破裂的新生血管造模方式 〔8〕。

1.5脂質(zhì)過氧化物誘導(dǎo)CNV模型

白兔視網(wǎng)膜下注射亞油酸過氧化物（LHP），CNV發(fā)生率為46%。造影見熒光素滲漏明顯，組織學(xué)可見RPE細胞吞噬、吞飲LHP，RPE肥大，RPE層下間隙電子致密物和殘余小體增加。由于白兔RPE細胞沒有色素，因而不易通過FFA分辨脈絡(luò)膜毛細血管與CNV；部分模型因CNV面積較小，未顯示滲漏。該模型為單次大劑量視網(wǎng)膜下注射LHP，與人長期暴露于LHP和其他氧化損傷分子的情況不符 〔9〕。

2　AMD相關(guān)候選基因修飾的AMD小鼠模型

研究證明AMD的病理過程涉及氧化應(yīng)激、免疫炎癥反應(yīng)以及脂質(zhì)和碳水化合物的代謝等。建立在分子遺傳學(xué)以及分子流行病學(xué)的基礎(chǔ)上，目前已選出多個AMD相關(guān)候選基因，隨之多種AMD相關(guān)候選基因修飾的AMD小鼠模型相繼建立。

2.1　單核細胞趨化蛋白-1（Ccl-2）或其受體（Ccr-2）敲除小鼠模型

巨噬細胞是清除補體及免疫復(fù)合物的主要細胞，其功能的缺失有利于補體和免疫復(fù)合物的堆積，這可能間接促進了AMD的形成。Ccl-2對單核細胞具有趨化活性，可激活單核細胞和巨噬細胞，并調(diào)控單核細胞和巨噬細胞的黏附分子和細胞因子的表達。研究顯示在Ccl-2及Ccr-2敲除小鼠的體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了類似人類AMD的病理改變，包括RPE內(nèi)脂褐素的沉積、玻璃膜疣的產(chǎn)生、光感受器細胞的萎縮和CNV的產(chǎn)生。超過9月齡的Ccl-2 -/-小鼠體內(nèi)可見類似玻璃膜疣的視網(wǎng)膜下沉積物，數(shù)量隨著年齡的增長而增多，并逐漸表現(xiàn)出Bruch膜增厚及其內(nèi)膠原及彈力層的斷裂，RPE細胞內(nèi)VEGF表達的上調(diào)，CNV的形成等類似于人類進展期的AMD。然而，作為一種免疫缺陷動物，此類小鼠的存活率以及成模率不甚理想 〔10〕。

2.2趨化因子受體1抗體基因敲除（Cx3crl -/-）小鼠模型

研究顯示在12月齡Cx3crl -/-小鼠眼底可觀察到大量視網(wǎng)膜變性，光感受器層明顯變薄，并觀察到了黃色結(jié)節(jié)樣類玻璃膜疣沉積物，通過持續(xù)光照或激光誘導(dǎo)，Cx3crl -/-小鼠產(chǎn)生CNV的概率明顯增高。實驗證明在視網(wǎng)膜內(nèi)，小膠質(zhì)細胞（MCs）是Cx3crl的唯一寄存細胞，且所有的MCs均表達Cx3crl，因此該模型可用于MCs與AMD病理機制的相關(guān)性研究 〔11〕。

2.3 Ccl-2／趨化因子受體Cx3crl雙基因敲除小鼠模型

Ccl-2 -/-小鼠與Cx3cr1 -/-小鼠雜交產(chǎn)生Ccl-2及 Cx3cr1雙基因敲除小鼠模型。實驗研究顯示6周齡的小鼠模型即可觀察到類玻璃膜疣的視網(wǎng)膜改變，并隨著年齡的增長變大融合，一些會形成疤痕樣萎縮灶；同時該模型還會出現(xiàn)RPE細胞異常和光感受器細胞的萎縮，15%的模型小鼠可觀察到CNV的形成。此外，Ccl-2 -/- Cx3cr1 -/-小鼠RPE細胞中能檢測到A2E的表達 〔12〕。該模型小鼠優(yōu)點是出現(xiàn)AMD病理改變要早于其他AMD模型小鼠，然而此模型造模技術(shù)要求高，建模難度大且成本高。

2.4 ApoE基因缺失（ApoE-/-）小鼠模型

AMD發(fā)病的年齡，ApoE基因（AMD的保護基因），高脂、高膽固醇飲食是AMD的重要影響因素。有研究顯示，對2月齡ApoE-/-小鼠進行高脂喂養(yǎng)4個月后出現(xiàn)小鼠光感受器細胞和RPE層細胞萎縮、排列紊亂，Bruch膜厚薄不均，膠原纖維分叉，分叉處可見玻璃膜疣 〔13〕。其作為AMD動物模型的優(yōu)點在于建模過程整合了3個AMD相關(guān)的發(fā)病因素，符合AMD多因素致病的特點，較符合AMD自然病程。但其缺點為ApoE基因與脂代謝相關(guān)，此動物模型的飼養(yǎng)過程又需一段時間的高脂、高膽固醇飲食，罹患動脈粥樣硬化導(dǎo)致的心血管疾病風(fēng)險較高，結(jié)合模型本身的高齡因素，此動物模型的成模率不高。最近有研究發(fā)現(xiàn)甲基-CpG結(jié)合域蛋白2（MBD2）與ApoE雙基因敲除小鼠，其玻璃膜的增厚明顯低于ApoE-/-小鼠，由此可能從基因角度發(fā)現(xiàn)新的有效的AMD治療方案 〔14〕。

2.5載脂蛋白Bl00（ApoBl00）轉(zhuǎn)基因小鼠模型

ApoBl00是一種血漿載脂蛋白亞型，是肝臟合成和分泌甘油三酯的VLDL所必須的載脂蛋白，此種基因的突變可引起多種脂蛋白的代謝紊亂。實驗研究發(fā)現(xiàn)，從12月齡的人ApoBl00轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)觀察到了一系列早期AMD的病理表現(xiàn)。包括Bruch膜明顯增厚及基底膜沉積物，RPE細胞的空泡形成，并且高脂飲食喂養(yǎng)該種小鼠可加劇這些病理表現(xiàn) 〔15〕。綜合可見，人ApoBl00轉(zhuǎn)基因小鼠可作為一種較理想的早期AMD動物模型，尤其適用于脂代謝相關(guān)的AMD研究。

2.6超氧化物歧化酶（SOD）基因修飾小鼠模型

SOD是一類分布于視網(wǎng)膜中的超氧自由基的消除劑，SOD-1則是其中在視網(wǎng)膜組織中含量最多的一種亞型，SOD-1基因的缺失會增強氧化應(yīng)激反應(yīng)對視網(wǎng)膜的損傷。實驗研究顯示在86%10月齡以上的Sod-1 -/-小鼠體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)類玻璃膜疣的視網(wǎng)膜沉積物，且10%的小鼠造影可發(fā)現(xiàn)CNV。進一步研究報道，5月齡的Sod-1 -/-小鼠在相當(dāng)于室外陽光能量的白光照射下可誘導(dǎo)玻璃膜疣 〔16〕。由此可見，Sod基因修飾小鼠可作為理想干性AMD研究模型，尤其適用于氧化應(yīng)激反應(yīng)與AMD致病機制的研究。

2.7　血漿銅藍蛋白（CP）/亞鐵氧化酶（HP）雙基因敲除小鼠模型

鐵與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，CP是一種鐵氧化酶，調(diào)節(jié)細胞中鐵的輸出。研究顯示缺乏CP功能的人，老齡時會出現(xiàn)玻璃膜疣和視網(wǎng)膜色素變性。小鼠缺乏CP功能也會出現(xiàn)視網(wǎng)膜變性，但由于另一鐵氧化酶（HP）的存在，這種改變比較輕微。實驗結(jié)果顯示6到9月齡的CP和HP雙基因敲除小鼠眼底觀察到了與AMD類似的病理表現(xiàn)，包括RPE的肥大和色素減退，視網(wǎng)膜下沉積，光感受器萎縮，視網(wǎng)膜下新生血管。超過12月齡的小鼠眼底表現(xiàn)巨噬細胞的浸潤視網(wǎng)膜自發(fā)熒光的增強以及更多的視網(wǎng)膜下沉積 〔17〕。但該模型小鼠存活率低，大部分低齡小鼠死于運動失調(diào)，影響了模型進一步研究。最近有研究顯示，一種鐵螯合劑（去鐵銅）可減輕該模型視網(wǎng)膜的損傷 〔18〕。

2.8補體因子H（CFH）基因敲除小鼠模型

CFH功能的缺失會導(dǎo)致補體C3在腎小球基底膜沉積，最終可導(dǎo)致膜增生性腎小球腎炎（MPGN），有趣的是在這些病人眼底觀察到了與AMD類似的玻璃膜疣形成。實驗結(jié)果顯示兩歲的CFH -/-小鼠也發(fā)生了MPGN以及類AMD的視網(wǎng)膜病理改變。包括ERG顯示a、b振幅均降低，視網(wǎng)膜自發(fā)熒光的增強，視網(wǎng)膜下沉積物的增多，光感受器外段的紊亂 〔19〕。補體C3的激活會增強β淀粉樣蛋白（Aβ）在基底膜的積存，進一步實驗研究發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白抗體可一定程度的降低CFH -/-小鼠的視網(wǎng)膜損傷 〔20〕。

2.9腦啡肽酶（NEP）基因敲除小鼠模型

有研究發(fā)現(xiàn)，Aβ特異性的沉積于AMD患者眼內(nèi)，并與玻璃膜疣的形成相關(guān)，而NEP具有降解Aβ的作用，NEP基因敲除小鼠可增加Aβ的沉積。實驗證明，27月齡的NEP基因敲除小鼠體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)Aβ沉積于RPE細胞層與Bruch膜之間，并可檢測出VEGF的高表達，同時伴隨色素上皮源性因子（PEDF）的低表達，符合氧化應(yīng)激反應(yīng)的表現(xiàn) 〔21〕。此外，視網(wǎng)膜下沉積以及RPE細胞的萎縮等類似早期AMD的病理改變也在模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。

3　其他AMD模型

3.1視網(wǎng)膜光損傷小鼠模型

AMD發(fā)病機制與長期低強度光損傷有關(guān)。實驗研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜光損傷的發(fā)生部位與AMD近似，外層視網(wǎng)膜，尤其是光感受器外段最早受累。通過2000 Lux白色冷光源對大鼠進行24 h持續(xù)性照射后，ERG顯示b波振幅下降至（80.986±26.286），為光照前的29.68%。電鏡下光感受器外節(jié)膜腫脹模糊，排列紊亂，膜間隙較大，出現(xiàn)分離、崩解、空泡變性；內(nèi)節(jié)線粒體腫脹，嵴端斷裂，部分空泡變性；外核層大量核膜皺縮、內(nèi)陷，染色質(zhì)聚集、濃度不均，可見較多凋亡細胞。SOD活力明顯降低，MDA和NO的含量明顯升高 〔22〕。該模型存在建模方式簡便快速的優(yōu)勢，但模型與人AMD的自然病程及病理表現(xiàn)還存在一定的差異。

3.2碘酸鈉誘導(dǎo)非滲出型AMD模型

研究結(jié)果顯示，予大鼠經(jīng)舌下靜脈分別注射30~40 mg/kg 的NaIO 3后，大鼠ERG顯示各種波的振幅明顯降低，眼底彩照顯示注射NaIO 3后3天出現(xiàn)部分視網(wǎng)膜壞死，視網(wǎng)膜壞死程度與注射后時間及注射量呈正相關(guān)。平片顯示，注射NaIO 3后3天單層RPE細胞出現(xiàn)壞死。體外實驗發(fā)現(xiàn)，濃度30 mg/L NaIO 3組RPE-19細胞增殖率降低。實驗證明NaIO 3誘導(dǎo)的PRE細胞凋亡受劑量和時間影響，劑量為30~40 mg/kg NaIO 3的模型適用于研究AMD的早期病理表現(xiàn) 〔23〕。

3.3聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)非滲出型AMD模型

實驗研究結(jié)果表明，在小鼠視網(wǎng)膜下注射0.5 mg PEG400五天后，會誘導(dǎo)32%視網(wǎng)膜外核層的變薄，61%光化學(xué)感受器內(nèi)外段長度的減少，49%外核層中心密度的降低，31%RPE密度增加。通過光電鏡還可以觀察到組織細胞凋亡的跡象以及變性的RPE細胞。基因組學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)注射后多個與AMD相關(guān)基因的高表達，例如補體C3，CFI，基質(zhì)金屬蛋白酶9，脂蛋白酯酶等。由此可見PEG誘導(dǎo)的模型具有非滲出性AMD形態(tài)學(xué)及基因表達雙重相似性 〔24〕。此前有研究顯示，在小鼠視網(wǎng)膜下注射1 mg具有更高聚合度的PEG8三天后，可以誘導(dǎo)出CNV，同時免疫組化結(jié)果可以檢測出補體C3、C9，VEGF，轉(zhuǎn)化生長因子β2及FGF等AMD相關(guān)因子的高表達 〔25〕。

3.4快速衰老（SAM）小鼠模型

SAM小鼠最初由日本京都大學(xué)在對AKR/J系小鼠進行常規(guī)近交系培育時意外發(fā)現(xiàn)的。小鼠在生命早期就出現(xiàn)了本該在老年期才出現(xiàn)的身體各部位功能衰老現(xiàn)象。該模型常用于老化相關(guān)實驗研究。分為兩類，呈現(xiàn)快速衰老易感的SAMP系以及呈現(xiàn)衰老抵抗型的SAMR系。實驗研究發(fā)現(xiàn)在8月齡的SAMP8小鼠身上可觀察到類AMD樣改變，包括玻璃膜的增厚，RPE基底部層狀及線樣沉積，以及小范圍的玻璃膜內(nèi)新生血管形成 〔26〕。

總之，AMD模型各有其優(yōu)缺點，相對好的模型存在造模技術(shù)要求較高，建模難度大且成本高等缺點，一定程度影響了AMD的研究。由于AMD涉及遺傳及環(huán)境因素，雖然目前建立的AMD模型方法繁多，但尚無一種模型可以完全再現(xiàn)人AMD的發(fā)展過程，因而有必要進一步研究,以尋找更佳的AMD模型。