缺血性卒中體外模型建立

郭安臣，趙一龍，蘇芳，李巍巍，王擁軍，王群

缺血性卒中占全部卒中的60%～80%，是由于腦血液供應障礙引起缺血、缺氧，營養剝奪，導致缺血中心的壞死和缺血周邊出現半暗帶區。即便恢復血液供應，也會造成再灌注損傷，導致患者的病情繼續加重。針對腦缺血損傷的主要措施是積極采取腦保護措施。基于腦保護研發的藥物在臨床前實驗中均表現出明顯的療效，而臨床試驗卻無法獲得理想的結果，沒有一種腦保護藥物通過美國藥品食品管理局的批準[1]。因此，從新的模型制作、新的藥物發現和保護機制進行更深入的研究對缺血性卒中的研究和臨床治療有更重要的意義。本文就腦缺血體外模型的現狀，制備方法進行綜述希望對腦缺血的研究提供參考。

1 缺血性卒中體外模型

1.1 神經元 神經元一直被認為是中樞神經系統中最重要的細胞，神經元的損傷、功能失調甚至凋亡將直接導致神經功能的缺失，因此既往很多治療腦血管病的神經保護藥物都以保護神經元為目標，其中原代培養的神經元和神經元細胞系相比更是受到研究人員的重點關注[2]。

神經元損傷主要涉及下列機制：①興奮性氨基酸的毒性作用腦缺血缺氧時大量興奮性氨基酸，尤其是谷氨酸的暴發性釋放，N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體過度激活，形成所謂的“興奮毒性”，造成突觸后神經元過度興奮、潰變、壞死[3]。②細胞內Ca2+超載，發生缺血性卒中時，電壓依賴性Ca2+通道開放，引起損傷性Ca2+內流，細胞外大量Ca2+內流入細胞內，此時的Na+流出細胞外，同時激活蛋白激酶C（protein kinase C）、磷脂酶C（phospholipase C）和磷脂酶D（phospholipase D）途徑，導致花生四烯酸堆積，對神經元造成損傷[4]。③自由基生成增加。自由基是指最外層電子軌道上含有一個或多個未配對電子的物質。可分為兩類：一類是由氧誘發的自由基稱為氧自由基；另外一類是氧自由基與多聚不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產物是脂自由基。氧自由基主要指O2-和-OH等，研究顯示，自由基損傷以缺血后再灌注時為最重，可能由于溪流和滴流的供血攜帶了微量氧進入組織，為維持脂質過氧化程序提供條件，加重自由基損傷[5]。④炎癥反應。已經證實，缺血損傷后產生組織炎癥反應，表現在炎癥因子上調，促黏附分子和黏附分子的表達增加。已知的致炎因子包括白細胞介素－1（interleukin-1，IL-1）、白細胞介素－6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等；黏附分子包括細胞間黏附分子1、內皮細胞選擇素、血管細胞黏附分子等[6-7]。小膠質細胞反應在大鼠全腦缺血標本也比較強烈，應激的小膠質細胞分泌IL-1β。動物實驗顯示，大腦中腦動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠局灶缺血區20 min內可見反應性小膠質細胞，缺血再灌注損傷后缺血中心區內充滿小膠質細胞。這些實驗提出抗炎治療是神經保護措施的理論依據[8]。⑤細胞凋亡不僅在發育過程中，而且在疾病發生中越來越受到人們的重視，它可能參與腫瘤、老年性癡呆等神經退變性疾病、艾滋病等疾病發生[9]。以前的研究認為，腦缺血過程中的細胞死亡是一種被動的壞死，然而最近的研究提示，缺血缺氧可能誘發神經細胞凋亡[10]。實驗發現，在缺血性損害的急性期及遲發性神經無損害期，凋亡細胞均存在，而在遲發性神經元死亡期以細胞凋亡為主。缺血性損害的急性期，凋亡細胞與壞死細胞并存，提示神經細胞凋亡與壞死均參與腦缺血急性期細胞損害，但各自程度與缺血損害的輕重有關。輕度缺血時壞死表現輕微，細胞凋亡成為細胞損害的主要形式。在遲發性神經元損害期，無論是輕度缺血還是重度缺血，細胞凋亡均是細胞丟失的主要形式。

1.2 神經膠質細胞 大腦由神經元和神經膠質細胞組成，生物的進化程度越高，膠質細胞在腦內細胞中所占的比例也越高，人腦內90%的細胞皆為膠質細胞。最新研究表明，神經膠質細胞在缺血性卒中的發病及治療過程中發揮重要作用，成為治療缺血性卒中的新靶點[11]。星形膠質細胞是腦內促紅細胞生成素的主要來源，促紅細胞生成素能夠減少神經元的凋亡，降低興奮性氨基酸毒性及一氧化氮（nitric oxide，NO）引起的細胞死亡。同時卒中后星形膠質細胞能夠表達血管樣表皮生長因子，這種血管樣表皮生長因子有明顯的神經保護作用，能夠抑制遲發性細胞凋亡；且能夠促進血管的再生，對缺血性卒中的康復有重要意義[12-14]。細胞移植實驗表明，移植到腦內的星形膠質細胞能夠高表達腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors）、血小板源性生長因子（plateletderived growth factors）、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein）等，而星形膠質細胞可通過這些細胞因子發揮神經保護作用[15]。

1.3 血管內皮細胞與血腦屏障 缺血性卒中除神經元及神經膠質細胞發生病理生理性改變外，向大腦供血的血管壁的完整性也遭到破壞。血管壁由血管內皮細胞和基底膜構成，正常情況下血管內皮細胞釋放活性因子，調節血管張力、凝血、纖溶功能及維持正常血壓均有一定的作用，一旦血管內皮細胞和基底膜受到損傷，可使血小板黏附、聚集，導致血栓形成，而且受刺激的內皮細胞可釋放促凝血因子參與外源性凝血過程，加速血栓形成[16-17]。

血管內皮細胞與基底膜、星形膠質細胞一起形成血腦屏障，血腦屏障能夠阻止損傷因子進入腦組織，同時也阻止了神經保護藥物進入腦組織發揮作用的可能性[18]。血管內皮損傷和缺血性卒中密切相關，目前對血管內皮細胞損傷的確切機制及防治方法尚未完全清晰，因此，進一步研究血管內皮細胞損傷的機制對治療缺血性卒中有重要意義。

1.4 腦片模型 細胞培養雖然具備實驗條件易于控制，方便操作，細胞的生物學特征明確，但是，由于脫離了體內環境，使其喪失了組織結構和細胞之間的聯系以及與之相關的生化特性。為了更好地研究缺血性卒中后各種細胞的變化，探索缺血性卒中的發病機制，尋找更有效的治療方法。有學者建立了腦片模型，它相對于原代腦內的各種細胞，腦片可在體外培養數周時間，能保留體內狀態下的細胞構成，突觸回路，受體分布，細胞間的相互作用和三維立體結構，具有正常和完整的突觸通路、遞質傳遞和電生理等功能；腦片培養排除了體內模型中血腦屏障（bloodbrain barrier）的干擾，可采用人工培養基或添加各種藥物，易于控制培養環境[19]。

1.5 神經血管單元 盡管國內外研究者圍繞缺血后神經元的損傷與修復機制進行了大量的研究并取得一定進展，但仍缺乏有效治療方法。過去對腦缺血損傷研究大多局限在神經元本身，或者將大腦中不同的細胞群體和結構分割開來研究，忽略了大腦功能的整體性和不同結構間的相互作用。2003年，美國科學家Lo等提出腦神經血管單元的概念。神經血管單元這一概念的提出，為臨床治療缺血性卒中提供了新的靶點。“腦神經血管單元”是由微血管（這些血管的內皮-基質-星形細胞足突復合體是一個完整的部分）、血管周圍的星形細胞突起及由這些突起所支持的神經元及軸突共同組成的復合體，包括神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞、血管內皮細胞、血管周細胞、基底膜及細胞外基質[20]。

2 模型制備與干預方法

缺血性卒中體外模型制備主要涉及細胞培養與干預。現對常用細胞培養及干預方法做簡要介紹。

2.1 體外細胞培養

2.1.1 經典原代神經元培養方法 多采用15～18 d孕齡的胎鼠或新生鼠，在無菌條件下取材、機械分離、酶消化等步驟獲得細胞懸液，接種至包被多聚賴氨酸的培養皿內，用添加B27的Neurobasal無血清培養基培養，并用阿糖胞苷抑制膠質細胞生長，可獲得純度較高的原代培養神經元，培養7～10 d后用于實驗[12]。

2.1.2 經典原代星形膠質細胞培養方法 經典原代星形膠質細胞培養方法是由McCarthy 和Vellis于1980年建立的。膠質細胞原代培養的取材過程與神經元原代培養類同，只是培養時換成利于膠質細胞生長的杜爾伯科極限必需培養基（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）完全培養基（含10%胎牛血清），體外培養l0～12 d后細胞融合并分層：上層主要為小膠質細胞，下層主要為星形膠質細胞。通過不同時間的水平搖動，使得小膠質細胞、少突膠質細胞、星形膠質細胞得以純化，并應用于相關實驗[22]。2.1.3 原代內皮細胞培養 一般從成年動物大腦皮質取材，剪刀破碎成1 mm大小，膠原酶消化后，經密度梯度離心或過篩方法獲得，然后接種至Ⅳ型膠原包被的培養板內，培養4～5 d后融合形成緊密連接的單層細胞[23]。

而建立體外血腦屏障模型，則需要同時培養血管內皮細胞和星形膠質細胞，將兩種細胞分別培養在Transwell細胞小室的上下層，通過測試通透性和跨內皮電阻（transendothelial electrical resistance，TEER）判斷血腦屏障模型的完成情況。進一步利用血腦屏障模型進行藥物及其他試驗[24]。

2.1.4 腦片制備 腦片制備多采用出生后6～8 d的乳鼠。低溫麻醉后，用75%的乙醇浸泡消毒，斷頭取腦，迅速轉移至預冷的人工腦脊液中，用振動切片機進行切片，切片厚度為200～400 μm。整個過程要無菌。腦片穩定過夜后可進行后續實驗[25]。

2.1.5 神經血管單元制作方法 神經血管單元制作以Transwell培養小室為媒介，結合原代神經細胞培養技術及大鼠微血管內皮細胞培養技術，將神經元、神經膠質細胞、腦微血管內皮細胞培養在一個體系中，同一體系的三種細胞培養成熟后，從形態學、屏障特性、特征性蛋白表達水平及niche環境的變化對神經血管屏障進行研究[26]。

2.2 制備缺血性卒中體外模型的干預方法 缺血性卒中的主要病因是由于血栓阻塞血管造成缺血缺氧區域的細胞發生病變，因此有關制備缺血性卒中模型的干預方法適用于所有細胞模型。

2.2.1 缺血、缺氧 氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）是使用低氧裝置結合無糖、無血清培養基或是向無糖培養基中持續通入不含氧的混合氣體（5%CO2+95%N2）來模擬缺糖、缺氧環境進行細胞培養。經缺血、缺氧處理一段時間后，再把細胞轉移到正常氧濃度和含糖培養基條件下繼續培養，以模擬細胞或組織缺血再灌注損傷的病理生理學過程。

2.2.2 興奮毒性 一般采用谷氨酸或谷氨酸鹽和NMD，NMDA等試劑。100 μmol/L的谷氨酸鹽作用于皮質神經元5 min即可造成大量損傷。在損傷的基礎上研究神經元損傷的機制，或者探索減輕損傷的方法。

2.2.3 自由基過度形成 自由基過度形成主要采用過氧化氫、叔丁基過氧化氫、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）等模擬腦缺血和缺血再灌注產生的活性氧（超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等）所引起的氧化應激損傷。模擬腦缺血時自由基過度形成的微環境，從而進行抗自由基或神經保護研究。

2.2.4 炎癥因子 對于體外培養的小膠質細胞或腦組織，可給予脂多糖誘導小膠質細胞活化，從而產生多種炎癥效應：TNF-α等炎癥因子的釋放，激活誘導型一氧化氮合酶合成NO，下調谷胱甘肽的表達等，對揭示缺血性腦卒中的免疫機制有重要意義。

2.2.5 細胞內鈣超載 鈣離子具有重要的功能，靜息狀態下細胞內鈣離子濃度約為100 nmol/L，比細胞外鈣離子濃度低2萬倍，這種跨膜濃度梯度差由多種機制維持，包括細胞膜對鈣離子通透性的限制、主動排鈣機制及細胞內鈣潴留等。各種損傷因素導致細胞內鈣離子濃度異常增加，可比正常時高出100～200倍，稱為鈣超載。鈣超載后細胞內線粒體出現功能障礙，激活鈣依賴性磷脂酶，釋放對細胞有毒性的物質；升高鈣調蛋白酶活性，導致細胞外鈣離子向細胞內流動，引起細胞死亡。細胞鈣超載模型可用咖啡因、氯化鉀、NMDA等誘導。

目前在抗腦缺血的機制及藥物篩選研究中，雖然整體動物模型比較接近于腦缺血病理狀態，但是由于實驗動物的個體差異較大，實驗人員在制備動物模型時的技術水平不同，對實驗結果容易造成影響。而且動物模型的制備有一定難度，損傷的均一性難以掌握，工作量大，周期長，花費高。而利用細胞模型則可以克服動物模型的不足。而且可以根據腦缺血病理生理機制中的不同進程，有選擇地從不同角度選用不同類型的細胞模型，對于研究缺血性卒中的發病機制及大規模篩選藥物有重要的意義。

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【點睛】

缺血性卒中體外模型對于研究發病機制，篩選神經保護藥物，探討治療方案具有重要意義。