長鏈非編碼RNA及其與結直腸腫瘤相關研究進展

·綜述·

長鏈非編碼RNA及其與結直腸腫瘤相關研究進展

謝宇梁德森李林強

作者單位：150001 哈爾濱醫科大學附屬第一臨床醫學院肛腸外科

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200 nt的RNA分子，因其缺乏有意義的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，不參與編碼蛋白質，而是直接以RNA的形式在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后等多種層面上調節蛋白編碼基因的表達[1]，其異常表達與包括惡性腫瘤在內的多種重大疾病的發生、發展密切相關[2]。

結直腸癌是目前世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，且隨著人們生活水平的提高和飲食結構及方式的改變，其發病率仍在逐年升高，早期診斷、早期治療對結直腸癌預后影響顯著。而lncRNA因其多重與腫瘤發生發展相關的功能特性及顯著的腫瘤組織特異性，展現出其在結直腸腫瘤早期診斷、預后判斷及靶向治療上的廣闊前景。本文就lncRNA及其在結直腸腫瘤中的研究進展作一綜述。

一、長鏈非編碼RNA概述

人類基因組計劃研究顯示，在由長達30億個堿基對組成的人類基因組中，最終得到確認的基因只有2.1萬個左右，即其中編碼蛋白質的序列只占全序列約1.5%，剩余98.5%為非蛋白質編碼序列[3]。這些非編碼序列曾被認為是進化過程中累積的“垃圾序列”。而在2003年啟動的ENCODE(encyclopedia of DNA elements)計劃經十余年研究發現，在全序列中大約有75%的DNA片段可以被轉錄為RNA，近74%為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[4]。其中絕大多數轉錄本長度超過200nt，稱為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。

(一)長鏈非編碼RNA的起源與結構特點

長鏈非編碼RNA于2002年由Okazaki等在對小鼠全長互補DNA(cDNA)文庫大規模測序中首次發現[5]。LncRNA起初被認為是RNA聚合酶Ⅱ低保真度轉錄的副產物，是基因組轉錄的“噪音”，并未得到重視。2007年，Rinn等[6]利用高分辨率芯片技術從11種成纖維細胞中鑒定分析出首個具有反式轉錄調控作用的lncRNA-HOTAIR，即HOX基因轉錄反義基因間RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA)。其通過作用于polycomb復合物蛋白，修飾染色質，從而抑制HOX基因的轉錄。此后，隨著越來越多功能性lncRNA的發現，人們逐漸認識到其廣泛參與X染色體沉默、基因組印記及染色質修飾、轉錄激活及干擾、核內運輸等多種重要的調控過程，lncRNA逐漸成為研究熱點。

全基因組高通量芯片以及cDNA文庫高通量測序顯示，lncRNA的編碼基因在基因組內廣泛分布，可位于編碼mRNA基因的外顯子或內含子中，或來自編碼mRNA基因之間的序列。根據其在基因組上相對于編碼mRNA基因的位置可分為正義(sense)、反義(antisense)、雙向(bidirectional)、基因內(intronic)及基因間(intergenic)五類。因其在序列同一個位置可形成多種不同的轉錄情況，推斷lncRNA起源至少包括下列5種：(1)蛋白質編碼基因結構中斷，由變態的編碼基因轉錄而來；(2)染色質重組，由原來缺乏外顯子的序列轉錄而來；(3)由非編碼基因在復制過程中的反轉錄生成；(4)由鄰近的復制子串聯后轉錄生成；(5)由編碼基因中插入轉座子轉錄生成[2]。

相對于編碼RNA及短鏈非編碼RNA而言，lncRNA初級序列保守性較低，但其分子內部卻具有某些高度保守的區段，且表達具有時空特異性[7]。Khalil等先后在小鼠與人類基因組中發現3289個基因間保守lncRNA，并考慮到由于實驗條件限制，其數量可能達4500個左右[8]。不同于mRNA必須保證密碼子正確以確保開放閱讀框有意義，lncRNA只需維持其二級結構的穩定，并對其功能起關鍵作用的區段保持高保守性，即在一級結構水平上呈低保守性，而二級結構呈保守性。

(二)長鏈非編碼RNA的作用機制與功能

LncRNA初級序列保守性低、起源多樣，但因其具有高保守性功能元件及相對穩定的二級結構，使之在調控基因表達方面有著相似的作用機制，現已發現的常見作用機制包括：(1)通過與mRNA形成互補雙鏈，進一步在Dicer酶作用下產生內源性的siRNA，進而使該mRNA沉默；(2)通過與mRNA形成互補雙鏈，干擾其剪切，從而生成不同的剪切形式；(3)通過在蛋白編碼基因上游啟動子區發生轉錄，影響下游基因的表達；(4)通過結合到特定蛋白質上調節相應蛋白質的活性；(5)通過結合到特定蛋白質上改變該蛋白的細胞質定位；(6)作為結構組分與蛋白質形成核酸蛋白復合體；(7)作為小分子RNA的前體分子；(8)通過抑制RNA聚合酶Ⅱ或者介導染色質重構及組蛋白修飾，影響下游基因的表達等[9]。

隨著更多功能性lncRNA的發現及對其作用機制的進一步探索，lncRNA調控蛋白質編碼基因表達功能已被廣泛認可，其對于基因表達的調控按層次大體上可分為：

1.表觀遺傳學水平調控：為lncRNA最重要功能之一。通過與染色質修飾酶相互作用，改變染色質構象，在不同發育階段激活或抑制可遺傳的等位基因的表達，使多細胞動物維持其表觀性狀。

2.轉錄水平調控：通過轉錄干擾、調控RNA聚合酶II、調節轉錄因子的結合與裝配、與調控DNA序列形成RNA-DNA-Triplexes等方法實現。

3.轉錄后水平調控：通過與互補的mRNA形成dsRNA，影響mRNA的加工、轉運、翻譯和降解等過程，從而影響基因表達[10]。

LncRNA通過多種復雜機制在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后等多層面上調節蛋白編碼基因的表達，其異常表達可導致包括惡性腫瘤在內的多種重大疾病的發生。

二、長鏈非編碼RNA與結直腸腫瘤

2009年Guttman等通過全基因組序列分析，發現lncRNA中特有的超保守元件在腫瘤細胞中存在廣泛表達。這類元件在正常細胞中廣泛分布于染色體的脆性位點及腫瘤相關區域，與原癌基因表達密切相關，起著抑制細胞凋亡的作用，而其異常表達則會導致細胞過度增殖，形成腫瘤[7]。2010年Khachane等通過分析全長人類基因cDNA數據庫，發現腫瘤相關lncRNA 的基因比例是腫瘤相關編碼基因的二倍，由此指出腫瘤相關基因更有可能表達出lncRNA[11]，甚至可通過測定其表達水平的變化輔助腫瘤早期診斷[12]。

隨著HOTAIR、H19、MALAT-1、HULC 等結直腸癌相關長鏈非編碼RNA發現，基于其不同功能而應用于結直腸腫瘤的鑒別、早期診斷與靶向治療成為了研究的熱點方向。

(一)HOX基因轉錄反義基因間RNA

HOX基因轉錄反義基因間RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)于2007年由Rinn等發現，是首個被發現的具有反式轉錄調控作用的lncRNA[6]，其編碼基因位于12q13.13。Gupta等發現HOTAIR能夠通過引導基因組PCR2重新定向，導致組蛋白H3上第27位氨基酸三甲基化(H3K27me3)，并且通過調節多個抑制基因的沉默來促進乳腺癌的浸潤與轉移[13-14]。

2011年Kogo等實驗證實HOTAIR在結直腸癌中高表達。其通過下調腫瘤轉移抑制基因的表達從而促進癌轉移[15]。在出現肝轉移的Ⅳ期結直腸癌癌組織中，HOTAIR水平顯著高于癌旁組織，且細胞分化程度低、腫瘤局部浸潤深，因此HOTAIR可作為判斷結直腸癌肝轉移及其預后的獨立指標。

(二)母源性印跡基因19轉錄因子

母源性印跡基因19轉錄因子(imprinted maternally expressed transcript，H19)基因表達于11p15.5，由4個內含子和5個外顯子構成，是首個被發現的非編碼基因。其第一外顯子可產生一個高保守的miRNA分子，即miR-675。2010年Tsang等研究發現，過表達的miR-675能夠促進結直腸癌細胞株的生長，與結直腸癌的發病密切相關[16]，顯示其可能成為結直腸癌治療的新靶點。

而Yoshimizu等[17]研究發現，H19的低表達導致小鼠結腸息肉數量顯著上升，顯示H19具有癌基因和抑癌基因的雙重功能。其轉錄本在肝癌、胃癌中水平升高，而在畸胎瘤、前列腺癌中水平降低，亦印證了這一特性。

Fellig等通過檢測37例結直腸癌的肝轉移灶上H19的表達情況，發現18例存在高表達，提示H19對結直腸癌肝轉移亦具有促進作用[18]。

(三)人肺腺癌轉移相關轉錄因子1

人肺腺癌轉移相關轉錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1，MALAT-1)長8708nt，其編碼基因定位于11q13.1。最初由Ji等在研究人非小細胞肺癌的轉移中發現[19]，通過調控基因表達的轉錄及轉錄后水平，增強肺腺癌細胞的運動性，參與腫瘤的侵襲與轉移。MALAT-1作為腫瘤標記物具有廣譜性，在結直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等癌組織中亦可見高表達。

2011年Xu等通過對原發結直腸癌組織及腸癌細胞系研究發現，其中MALAT-1的3’ 末端區域均存在突變，對癌細胞的增殖、侵襲、轉移均起著重要作用[20]。常建蘭等發現MALAT-1在大腸腺瘤、正常大腸黏膜和大腸癌中表達量依次增高[21]，為結直腸腺瘤與結直腸癌的鑒別提供了有力依據。

(四)結腸癌相關轉錄因子1，2

結腸癌相關轉錄因子1，2(colon cancer associated transcript-1，2，CCAT-1，CCAT-2)由Nissan等[22]利用代表性差異分析法發現，而CCAT-2則于2013年由Ling等[23]首次報道。其編碼基因位于染色體組8q24，而結直腸多發腺瘤的發生與該區多態性密切相關，提示CCAT與結直腸腺瘤發生相關[24]。其在結直腸癌前病變、原位癌、結直腸癌侵襲邊緣組織、結直腸癌淋巴結轉移瘤、結直腸癌肝轉移瘤中表達逐級增強，而在正常結直腸組織內無表達，因此可作為結直腸癌早期篩查及診斷的特異性標志物之一。

(五)肝癌高表達轉錄因子(highly up-regulated in liver cancer，HULC)

由Panzitt等[25]在肝癌組織中發現，是首個肝癌細胞特異性高表達的lncRNA，長約500nt，基因定位于6p24.3。Matouk等[26]發現只有在原發性肝癌及結直腸癌肝轉移的繼發性肝癌中可檢測到特異性高表達的HULC，而在原發性結直腸癌、淋巴結轉移的結直腸癌或非肝轉移的腫瘤中則無法測得。HULC可在肝癌患者的血液中被檢測到，因而可能成為一種新的肝癌或結直腸癌肝轉移標志物。

除上述與結直腸癌相關的經典lncRNA外，尚有結直腸腫瘤形成差異表達基因轉錄因子(colorectal neoplasia differentially expressed，CNRDE)、母本印跡表達基因3轉錄因子(maternally expressedgene3，MEG3)、前列腺癌相關非編碼RNA轉錄因子1(prostate cancer-associated ncRNA transcripts 1，PCAT-1)等多種lncRNA以不同方式調節癌及抑癌基因表達，從而與結直腸腫瘤的發生、發展密切相關。

三、長鏈非編碼RNA在結直腸腫瘤中發展前景展望

隨著越來越多在結直腸腫瘤發生發展各階段起重要調控作用的長鏈非編碼RNA的發現，其成為結直腸腫瘤研究領域的新熱點。我們對于lncRNA的研究剛剛起步，僅對HOTAIR、H19、MALAT-1等幾種lncRNA作用機制較為清楚，隨著更多功能性lncRNA被發現，我們更多了解其與腫瘤發生發展的關系，但對其具體的分子機制尚不明了。因此在我們探索lncRNA實際作用時，也有必要進行更多的結構和功能的研究。而隨著生物技術的發展和研究的不斷深入，也許在不久的將來，特異性lncRNA可作為早期診斷及預后判斷標志物或新的治療靶點應用于臨床。

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(本文編輯：馬天翼)

謝宇，梁德森，李林強.長鏈非編碼RNA及其與結直腸腫瘤相關研究進展[J/CD].中華結直腸疾病電子雜志，2015，4(2)：170-172.

(收稿日期：2015-01-19)

通訊作者：梁德森，Email： hydpw8@163.com

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2015.02.13