上調miR-519d對喉鱗癌細胞增殖及凋亡的影響

沈納　白廣平　高天樂　黃新生　李俊

(1. 復旦大學附屬中山醫院耳鼻咽喉科，上海　200032；

2. 復旦大學附屬中山醫院青浦分院耳鼻咽喉科，上海　201700)

·論著·

上調miR-519d對喉鱗癌細胞增殖及凋亡的影響

沈納1白廣平2高天樂2黃新生1李俊2

(1. 復旦大學附屬中山醫院耳鼻咽喉科，上海200032；

2. 復旦大學附屬中山醫院青浦分院耳鼻咽喉科，上海201700)

摘要目的：研究miR-519d對喉鱗癌細胞增殖及凋亡的調控作用。方法： 采用RT-PCR、Western印跡等技術檢測人喉癌上皮細胞株Hep-2及人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelium cell，HBE)中信號轉導和轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)以及miR-519d的表達情況；通過質粒轉染上調Hep-2細胞株中miR-519d的表達后，采用細胞增殖及凋亡檢測技術觀察轉染細胞與對照細胞的增殖及凋亡情況。結果： STAT3 mRNA在Hep-2中的表達明顯高于其在HBE細胞中的表達(P<0.05)，而miR-519d在Hep-2中的表達明顯低于其在HBE中的表達(P<0.05)。STAT3在轉染miR-519d后的Hep-2細胞中的表達明顯下降(P<0.05)。轉染后繼續培養0～7 d，轉染后Hep-2細胞的增殖率明顯低于未轉染細胞(P<0.05)。 轉染后繼續培養24 h，轉染miR-519d的細胞凋亡率為(2.80±0.15)%，對照細胞的凋亡率為(0.92±0.09)% (P=0.000 4)。轉染后繼續培養72 h, 轉染miR-519d的細胞凋亡率為(23.06±3.52)%，對照細胞的凋亡率為 (23.26±2.56)%(P=0.965 5)。結論： STAT3在Hep-2細胞中高表達，而相關的miR-519d呈低表達，通過上調miR-519d可以抑制STAT3的表達從而抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的凋亡。

關鍵詞喉鱗癌；miRNA-519d；STAT3； 增殖；凋亡

中圖分類號R739.65

文獻標識碼A

Effect of Up-Regulating miR-519d on Proliferation and Apoptosis of Laryngeal Squamous Cell CarcinomaSHENNa1BAIGuangping2GAOTianle2HUANGXinsheng1LIJun2

1.DepartmentofOtolaryngology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.DepartmentofOtolaryngology,QingpuBranchofZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201700,China

AbstractObjective： To investigate the effect of up-regulating miR-519d on proliferation and apoptosis of laryngeal squamous cell carcinoma. Methods： The expression of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and miR-519d in human laryngeal carcinoma epithelium cell line Hep-2 and human bronchial epithelium cell(HBE) were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting. After up-regulating miR-519d expression in Hep-2 cell line by plasmid transfection technique, the proliferation and apoptosis of transfected cells and control cells was detected by proliferation and apoptosis assays. Results： STAT3 mRNA expression in Hep-2 cells was significantly higher than that in HBE cells (P<0.05). However, miR-519d expression in Hep-2 cells was significantly lower than that in HBE cells (P<0.05). The STAT3 mRNA expression in the transfected Hep-2 cells decreased significantly. During 0 and 7 day of post-transfection culture, proliferation rate of transfected Hep-2 cells was significantly lower than that of untransfected cells (P<0.05). After 24 h culture, the apoptosis rate of miR-519d transfected cells was (2.8±0.15)%, while that of control cells was (0.92±0.09)% (P=0.000 4). After 72 h culture, the apoptosis rate of miR-519d transfected cells was (23.06±3.52)%, while that of control cells was (23.26±2.56)% (P=0.965 5). Conclusions： STAT3 shows high expression in Hep-2 cell, while the related miR-519d shows low expression. By up-regulating miR-519d, STAT3 expression could be suppressed, so as to suppress the proliferation of tumor cells and promote the apoptosis of tumor cells.

Key WordsLaryngeal squamous cell carcinoma;miRNA-519d;Signal transducer and activator of transcription 3;Proliferation;Apoptosis

喉癌是耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，近年來其發病率明顯增長。喉癌中93%～99%為喉鱗狀細胞癌。目前對喉癌特別是晚期喉癌尚無滿意的治療方法[1]。微小RNA(microRNAs, miRNAs)是基因表達的重要調控因子。研究[2]顯示，許多miRNAs的功能與細胞增殖、分化和凋亡等有關；miRNAs直接或間接導致了腫瘤的發生，是腫瘤治療研究的潛在靶點。我們在以往研究的基礎上，采用生物信息學軟件(TargetScan)對特異性miRNAs進行靶基因預測篩選，發現喉癌的多個特異性miRNAs有一個共同的靶基因—信號轉導和轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)。通過調控STAT3，特異性的miRNAs可能在喉癌的發生發展中發揮重要作用。研究喉癌中特異性的miRNAs對STAT3的作用及其調控機制意義重大。

1資料與方法

1.1細胞株和試劑喉癌細胞株Hep-2、人支氣管上皮細胞株(human bronchial epithelium cell, HBE)購自中國質粒載體細胞基因保藏中心。轉染試劑LipofectaminTM2000購自美國Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM培養液購自美國Gibco公司。PCR試劑盒購自美國LifeScience公司，Western印跡試劑盒購自中國碧云天生物技術研究所。引物設計由上海杏園生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1引物序列設計采用在線設計軟件設計STAT3的RT-PCR引物序列，上游引物：5′-GGCCCAATGGAATCAGCTACAG-3′，下游引物：5′-GAAGAAACTGCTTGATTCTTCG-3′。hsa-miR-519d成熟體序列：CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG；寡聚單鏈DNA序列設計：5′-TGCTGCAAAGT-GCCTCCCTTTAGAGTGGTTTTGGCCACTGA-CTGACCACTCTAAGGAGGCACTTT-3′、5′-CC-TGAAAGTGCCTCCTTAGAGTGGTCAGTCAG-TGGCCAAAACCACTCTAAAGGGAGGCACTT-TGC-3′。

1.2.2Hep-2、HBE細胞培養及STAT3和miR-519d表達檢測使用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM(含1.5 mmol/LL-谷胺酸、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素)于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養細胞。采用RT-PCR法和Western印跡法檢測Hep-2、HBE細胞中STAT3的表達情況，以RT-PCR法檢測miR-519d的表達情況。

1.2.3Hep-2細胞轉染及表達檢測在1.5 mL EP管中加入75 μL(25 μL/孔×3孔)Opti-MEM I，再加入不同劑量的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-negative，混勻；取另一1.5 mL EP管，加入75 μL(25 μL/孔×3孔)Opti-MEM I，加入相應劑量的LipofectaminTM2000，混勻；室溫放置5 min后將兩管混合，室溫放置20～30 min。將轉染混合物加入含50 μL無血清DMEM的事先鋪上細胞的96孔板中，混勻后，在37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中溫育4～6 h。吸去轉染液，用D-Hank’s solution漂洗后，加入DMEM完全培養基，37℃培養24 h。采用RT-PCR和Western印跡檢測miR-519d及STAT3的表達。

1.2.4Hep-2細胞轉染后細胞增殖實驗細胞培養過夜后，傾去培養液，用3 mL D-Hank’s solution洗滌細胞兩次。加1 mL Trypsin-EDTA solution, 混勻后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3～5 min。加入 6 mL 含10% FBS的培養液，吹打使細胞形成單細胞懸液。用血球計數板計數后將細胞稀釋至3×105細胞/mL。按2.5×103細胞/孔的密度接種96孔板，同時設置對照組，即直接在孔中加入100 μL DMEM培養基；每組設7重復，于37℃、CO2體積分數為5%的條件下培養。轉染后0～7 d，將相應孔吸去培養液，加入新鮮的培養基100 μL，每孔避光加入CCK8 10 μL，避光培養1～4 h后，用酶標儀于490 nm波長處測光密度(D)值。

1.2.5細胞凋亡實驗用不含EDTA的胰酶消化細胞，離心收集細胞。后用400 μL 1×Binding Buffer懸浮細胞，密度大約為1×106細胞/mL。在細胞懸浮液中加入5×Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8℃ 避光條件下孵育15 min。加入10×PI 后輕輕混勻于2～8℃，避光條件下孵育5 min。在 1 h 內用流式細胞儀檢測。

2結果

2.1STAT3和miR-519d在HBE及Hep-2細胞中的表達情況

2.1.1RT-PCR結果STAT3在Hep-2中的mRNA表達水平明顯高于其在HBE中的表達(P<0.05，表1、圖1A)，而miR-519d在Hep-2中的表達水平明顯低于其在HBE中的表達(P<0.05，表2、圖1B)。

A： STAT3在Hep-2中mRNA的表達明顯高于在HBE中的表達(*P<0.05); B: miR-519d在Hep-2中的表達明顯低于HBE中的表達(*P<0.05); C: STAT3在轉染后的細胞中的表達明顯下降(*P<0.05); D: 轉染后 miR-519d在轉染細胞中的表達明顯高于對照細胞(*P<0.05); E: Western印跡的灰度值證實了STAT3在Hep-2細胞中的高表達; F: Western印跡的灰度值證實了上調miR-519d可以抑制STAT3的表達

圖1　HBE、Hep-2細胞中STAT3及miR-519d的表達

2.1.2Western印跡檢測實驗STAT3在Hep-2中的蛋白表達水平明顯高于其在HBE中的表達(P<0.05，表3、圖1E)。

2.2miR-519d 轉染Hep-2細胞的轉染效率及其對STAT3的調控作用miR-519d在轉染細胞及對照細胞中的表達通過qRT-PCR檢測，而STAT3在轉染細胞和對照細胞的表達通過qRT-PCR 和 Western印跡檢測。結果顯示，轉染后 miR-519d在轉染細胞中的表達明顯高于對照組(圖1D，P<0.05)，STAT3在轉染后的細胞中的表達明顯下降(表4，圖1C、1F，P<0.05)。

2.3上調miR-519d可以抑制Hep-2細胞的增殖在轉染后我們對miR-519d轉染的Hep-2細胞和未轉染的對照細胞進行細胞增殖實驗。我們觀察到，在轉染后繼續培養0～7 d，轉染細胞的增殖率明顯低于未轉染細胞(圖2,P<0.05)。

2.4上調miR-519d可促進Hep-2細胞的早期凋亡在轉染后繼續培養24 h，轉染miR-519d的細胞凋亡率為 (2.8±0.15)%，對照細胞的凋亡率為(0.92±0.09)% (P=0.000 4)。繼續培養72 h, 轉染miR-519d的細胞凋亡率為(23.06±3.52)%，對照細胞的凋亡率為(23.26±2.56)% (P=0.965 5)。見圖3。

A、B: 培養24 h后流式細胞儀檢測轉染細胞和對照細胞凋亡率所得的結果； C、D: 培養72 h后流式細胞儀檢測轉染細胞和對照細胞凋亡率所得的結果； E: 24 h時轉染細胞的凋亡率高于對照組(*P<0.05)，而72 h時兩者的凋亡率無明顯差別(P>0.05)

圖3上調miR-519d對Hep-2細胞凋亡的影響

3討論

STAT3目前已被定義為癌基因，它是腫瘤信號轉導的研究熱點，許多癌組織和源于腫瘤的癌細胞株均有STAT3的表達[3]。王俊閣等[4]用免疫組織化學法檢測50例喉癌標本和10例癌旁正常組織標本時，發現STAT3及磷酸化STAT3在癌組織中高表達，而癌旁組織為陰性。鐘剛等[5]和張寒冰等[6]通過RT-PCR檢測發現：與對照組正常癌旁組織相比，STAT3在喉癌中表達增高(P<0.05)，STAT3的過量表達可能在喉癌的發生、發展中起重要作用。文獻[5]發現STAT3活性增高是喉癌的早期事件，阻斷STAT3表達有可能抑制喉癌的發展。本研究發現STAT3 在Hep-2細胞中的表達明顯高于正常氣管黏膜上皮細胞(P<0.05)。

同時我們在以往研究的基礎上，通過生物信息學軟件(TargetScan)在對特異性miRNAs進行靶基因預測篩選時，發現喉癌的多個特異性miRNAs有一個共同的靶基因——STAT3。通過調控STAT3，特異性的miRNAs可能在喉癌的發生發展中發揮十分重要的作用。因此，本研究選取miR-519d這個特異性miRNA進行研究，以探討其對STAT3的調控作用，觀察其對腫瘤增殖及凋亡的作用。本研究表明，在Hep-2細胞中miR-519d的表達明顯低于正常氣管黏膜上皮細胞(P<0.05)，因此，miR-519d可能通過負向調控STAT3來影響腫瘤的增殖及調亡。

本研究發現，在上調miR-519d的表達后，Hep-2細胞中的STAT3表達明顯下降(P<0.05)，進一步證實了miR-519d對其的負性調控作用。同時，我們觀察了上調miR-519d的Hep-2細胞在0～7 d的增殖情況，其增殖幅度明顯低于對照組(P<0.05)，所以我們推斷，miR-519d通過負性調控STAT3而影響腫瘤細胞的增殖。

此外，研究[7-8]表明，上調STAT3的表達可以促進Bcl-2的表達，從而抑制腫瘤細胞凋亡；通過抑制STAT3信號通路可以誘導凋亡。我們的研究發現，通過上調miR-519d可以抑制STAT3的表達，從而使轉染后24 h時的腫瘤細胞凋亡明顯增加(P<0.05)，而轉染后72 h時兩組的細胞凋亡率差異無統計學意義，因此，抑制STAT3通路可以誘導腫瘤細胞早期凋亡的發生。

綜上所述，在Hep-2細胞中，STAT3高表達，而miR-519d呈低表達，通過上調miR-519d可以抑制STAT3的表達從而抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的凋亡。

參考文獻

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通訊作者李俊，E-mail：lijun_ent@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：81001201)；上海市科學技術委員會基金項目(編號：14DZ1940703)；上海市青浦區科學技術發展基金項目(編號：2011-19)