構建生物心臟起搏器的種子細胞的研究進展

姬瑞娟 綜述 楊向群 審校

·綜述·

構建生物心臟起搏器的種子細胞的研究進展

姬瑞娟 綜述 楊向群 審校

隨著基因工程、干細胞、組織工程、再生醫學等領域的深入研究，使用細胞移植、組織工程方法構建生物心臟起搏器有望成為今后的發展方向。這些方法的基礎和關鍵是找到理想的種子細胞。目前，用于構建生物心臟起搏器的種子細胞有成體細胞和干細胞。本文就構建生物心臟起搏器的種子細胞的研究進展進行綜述。

生物心臟起搏器 成體細胞 干細胞

所謂生物心臟起搏器，是指運用生物學原理和相關技術，利用具有起搏功能的細胞或組織來替代病損的起搏或傳導組織，以達到重建、恢復心臟起搏和傳導功能的目的[1]。隨著基因工程、干細胞、組織工程、再生醫學等領域的蓬勃發展，生物心臟起搏器有望能克服電子起搏器的不足，如：①起搏頻率不能隨患者的生理狀態的變化而變化；②使用年限；③易受磁場干擾；④更換電池所致的再次手術損傷等。

構建生物起搏器的方法包括基因轉染[2]、細胞移植[3]和組織工程[4]等。其中，使用細胞移植、組織工程方法構建生物心臟起搏器可能是今后的重要發展方向，其基礎和關鍵是找到理想的種子細胞。目前，用于構建生物心臟起搏器的種子細胞有①成體細胞：竇房結細胞、幼稚心臟細胞及經基因修飾的心肌工作細胞等；②干細胞：包括胚胎干細胞（ES）、誘導性多能干細胞（iPS）和骨髓間充質干細胞（BMSCs）等。

1 成體細胞

竇房結是正常心臟的起搏點，其主要工作細胞就是竇房結細胞（P細胞）。將異體正常竇房結細胞移植到受體心臟，替代功能障礙的原有節律點，可重新啟動心臟的泵血活動。Ruhparwar等[5]首次將急性分離的胎犬心房肌細胞（含竇房結細胞）移植到成年犬的左室前壁，移植細胞可存活，并與宿主心肌細胞形成縫隙連接。利用射頻消融損毀房室結后，可檢測到來源于細胞移植部位的室性逸搏心律。Lin等[6]將胎兒心房肌細胞（竇房結細胞）移植到豬的左心室游離壁。結果顯示，移植細胞能存活，供體心肌和宿主細胞間connexin-43和N-cadherin表達陽性，3周后射頻消融房室結，心室跳動的頻率加快，并且起搏功能可受藥物調節。電生理研究發現，心室節律來源于細胞注射區域。Cai等[7]用新生豬的心房肌細胞（含竇房結細胞）重復了上述研究，得出了同樣的結論。張浩等[8-10]利用動物自體組織細胞進行了移植研究，分別取未成年豬竇房結細胞、成年犬竇房結細胞和心耳肌細胞，自體移植到右室前壁和右室近心尖部。在造成完全性房室傳導阻滯后，發現移植組心室率高于對照組，且心律均起源于細胞移植部位，對異丙腎上腺素的調節敏感，移植細胞之間以及移植細胞與心肌細胞之間形成了縫隙連接。Zhang等[11]后來又提出移植細胞構建生物起搏器，需要考慮移植部位的環境對生物起搏器的影響。

但這類組織細胞移植的缺點是：①供體來源困難，特別是自體細胞；②異體細胞存在排異問題；③成熟的P細胞對移植部位的微環境適應性差。因此，未來臨床應用的前景尚不明確，但這些研究為構建生物起搏器提供了可行性依據。

2 干細胞

干細胞具有很強的自我更新和多向分化能力，可分為胚胎來源干細胞、成體干細胞及誘導性干細胞三類。

2.1 胚胎來源干細胞

目前運用于生物心臟起搏器研究的胚胎來源干細胞主要為胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）和胚胎心臟祖細胞。前者源自內細胞團，可分化為3個胚層的任何細胞。Kehat等[12]成功地在體外將人ESCs誘導分化為心肌樣細胞，其中8.1%的細胞出現自發性搏動。將誘導后的hESCs移植至豬心室壁，能成功起搏完全性房室傳導阻滯的心室。Xue等[13]報道，基因修飾后的hESCs來源的心肌細胞，可在體外使靜止的心室肌細胞產生節律性的電-收縮活動，將細胞移植至豚鼠心室肌，發現電活動從注射部位向周圍心肌傳播，最后起搏心室肌。

上述ESCs來源的心肌細胞一般是從類胚體中跳動區域分離得到的，這些早期的心肌細胞具有起搏細胞的特性，可作為構建生物起搏器的種子細胞，但這些細胞的數量少、純度不理想。為了能夠從ESCs中分離獲得更多、更純的起搏細胞，大量研究聚焦于Pitx2c、Shox2、Tbx、HCN等。Guddati等[14]首次將胚胎心肌發育相關的轉錄因子Pitx2c過表達于ESCs，獲得了心肌樣細胞，可作為生物心臟起搏器的種子細胞。Ionta等[15]直接將與起搏細胞發育相關的轉錄因子Shox2基因轉染至小鼠ESCs，獲得了起搏細胞并成功構建了生物起搏器。也有研究用起搏細胞特征標志物來分離的，Hashem等[16]用Shox2啟動子和Cx30.2增強子從ESCs分離出的細胞也具有起搏細胞的特征，可作為生物心臟起搏器的種子細胞。Morikawa等[17]則從ESCs中直接分離出HCN+的細胞，Scavone等[18]則發現ESCs中CD166+的細胞可發育為竇房結樣細胞，這些細胞高表達竇房結細胞發育的相關標志Tbx18、Tbx3、Isl-1和 Shox2等，以及功能標志 Cx30.2、HCN4、HCN1、CaV1.3等；并低表達心室肌基因Cx43、Kv4.2、HCN2、Nkx2.5。Jung等[19]用人Tbx3+MYH6作為啟動子，從小鼠胚胎來源的多能干細胞中得到了80%以上的起搏細胞，而且搏動頻率達到了每分鐘300～400次。Rimmbach等[20]用同樣方法，得到了80%以上的起搏細胞，而且搏動頻率達到了每分鐘400～500次，與正常的心肌細胞相似。最重要的是，上述研究獲得的起搏細胞都可以在體驅動小鼠心肌細胞，為心臟組織工程和生物起搏器的構建研究提供了理想的種子細胞。

內皮素-1和神經調節蛋白-1在心臟發育中具有重要的作用[21-23]，也被用于促進鼠和人ESCs向起搏細胞的分化[24-25]。所謂的胚胎心臟祖細胞指的是取自胚胎心管的細胞。我們的研究發現，該細胞經誘導后可在體外形成竇房結樣細胞[26-27]。此外，Wiese等[28]用蘇拉明將小鼠ESCs誘導為竇房結細胞，證實了Ca2+激活的鉀通道在誘導ESCs，以及ESCs源性心肌多能干細胞向起搏細胞分化中的作用[29-30]。

關于ESCs細胞的研究證實了ESCs可以向心肌或起搏細胞誘導分化，用于生物心臟起搏器的構建，但這些細胞始終存在倫理學的問題，免疫原性、成瘤性問題也一直受到關注。此外，控制ESCs分化、準確定向誘導等問題尚亟待解決。

2.2 成體干細胞

與胚胎來源的干細胞相比，成體干細胞具有以下優勢：①獲取相對容易；②來源于患者自身，不存在組織相容性問題，避免了移植排斥反應和使用免疫抑制劑；③理論上成瘤風險低，而且倫理學爭議較少。成體干細胞中以骨髓間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）和脂肪來源的干細胞（Adipose-derived stem cell，ASCs）應用較多。但是，一般認為成體干細胞不具有心肌或起搏細胞相應的離子通道或相關結構，向起搏細胞的分化相對困難，只有通過轉基因或特殊的誘導方法才能獲得起搏細胞的特性。

2.2.1 起搏基因轉染

Potapova等[31]采用電穿孔轉染的方法將HCN2基因轉入hMSCs，然后移植到犬左室的心外膜下，可形成異位起搏點，植入的細胞與鄰近心肌細胞形成了縫隙連接。Plotnikov等[32]進行了類似的實驗，持續觀察了6周，并對注射細胞的數量進行研究，發現細胞數須大于700 000個。Lu等[33]將小鼠的HCN4轉染至犬骨髓MSCs，再注射至完全房室阻滯的犬左室前壁，最大心率快于正常組，運動后的心律變異度高于正常組。Zhang等[34]用腺病毒將HCN4基因導入豬（自體移植）完全心臟阻滯的右室壁，2周后心率提高，對腎上腺素產生反應。更多的研究在體外證實，通過多種方法將HCN轉染至MSCs，MSCs可以有心肌或起搏細胞的一些特征標志物，產生If[35-37]。Valiunas等[38]共培養HCN轉染細胞與心肌細胞，觀察到Connexin-40、Connexin-43和Connexin-45均高度表達，通過這種縫隙連接，心肌從HCN轉染細胞獲得到了If，表明HCN轉染細胞須與心肌細胞形成一個起搏單元，才能完成起搏功能。Nong等[39]將鼠HCN4轉染至大鼠MSCs，再移植至心室肌片，發現HCN4-MSCs只產生If，而未產生理想的動作電位或去極化激活的內向鈉流或鈣流，似乎也驗證了以上說法。若在MSCs轉染HCN的同時，再過表達Cx45，則與其共培養的心肌細胞跳動頻率會大大提高[40]。

2.2.2 化學誘導法

5-氮胞苷作為誘變劑主要用來將干細胞誘導分化為心肌細胞。Wakitani等[41]首次證實5-aza可誘導MSCs分化為肌性細胞。Makino等[42]研究發現，5-aza誘導后的骨髓MSCs能觀察到自發跳動和類似心肌細胞的動作電位；RT-PCR的結果表明，誘導后的細胞含有心肌RNA。Rangappa等[43]首次用5-aza將脂肪來源的ASCs誘導為跳動的心肌細胞。按照各類心肌細胞的特點，上述誘導后的細胞已經具備了起搏細胞特征。Yang等[44]比較了骨髓和脂肪來源的MSCs向起搏細胞分化的能力，認為ASCs更容易被誘導，其HCN的表達也高于BMSCs源性起搏細胞。然而，更多的研究沒有能夠觀察到5-aza誘導后的BMSC或ASCs出現跳動，但大部分可以表達心肌細胞的標志，這可能與種屬、細胞來源、5-aza的濃度以及培養的方法有關。Otaka等[45]用5-aza處理Nanog+的人羊膜上皮細胞，細胞可以表達HCN4和Kir2.1。值得注意的是，5-aza是一種細胞毒性物質，劑量過大可導致細胞死亡，而小劑量的5-aza又不能使MSCs向心肌細胞分化；另外，5-aza還具有致突變作用。因此，該方法誘導起搏細胞只能用于體外實驗研究，誘導出的起搏細胞也未見用于在體研究。

2.2.3 心肌細胞或竇房結細胞微環境培養法

微環境是影響干細胞分化的重要因素，因此利用心肌細胞、竇房結細胞共培養，或者用心肌細胞裂解液、條件培養液等誘導成體間充質干細胞向心肌細胞或竇房結細胞分化的方法被廣泛采用。分化后的細胞能否收縮或搏動，各研究報道不一，可能與細胞來源、狀態、培養條件及時間有關。尤其是分化后的細胞是否具有起搏細胞的特性，更是較少涉及。對BMSCs，有報道肯定了在心肌微環境下可以表達起搏細胞相關標志[46]，部分研究還測到了If[47-48]。 宋波等[49]用大鼠竇房結組織與大鼠MSCs共培養，隨培養時間延長（1～3周），PCR和免疫熒光都顯示Cx40和HCN4 mRNA和蛋白表達水平均逐漸增加。

在對ASCs在心肌組織微環境下起搏細胞的分化研究中，但大多數未觀察到分化的細胞產生跳動，有些是觀察到了細胞的“跳動”，但對起搏特性的鑒定證據不足。Gaustad等[50]將人皮下脂肪來源的ASCs置于含有大鼠（4～6周齡）心肌提取液的培養基中，3周后細胞出現跳動現象，但未檢測起搏細胞標志。只有Choi等[51]研究發現，取人皮下ASCs，與新生大鼠心肌細胞共培養（接觸），1周時細胞就有自主搏動，可檢測到鈣瞬變，與周圍心肌有縫隙連接，并同步收縮，具備了一定的起搏細胞特征。

2.2.4 脂肪來源干細胞“自發”分化

上述各種方法使成體干細胞誘導為起搏（樣）細胞，或多或少都有一定的局限性。其他眾多研究，則在尋找能夠“自發”地分化為起搏細胞的方法。所謂“自發”，主要指不需要加特殊的誘導劑，可能在培養基內某些未知的因素作用下，成體干細胞也可以像ESCs一樣，可以“自發”地向起搏細胞分化。Planat-Bénard等[52]首次證實了取自鼠腹股溝和肩胛部的ASCs在甲基纖維素培養基中，可以自發地分化為跳動的心肌細胞，細胞能產生自發動作電位，并提供了藥理學檢測證據，他們認為是心肌細胞中混有起搏細胞。Palpant等[53]使用相似的培養基培養取自小鼠肩胛區的ASCs，也得到了一致的結果，并初步研究了其分化機制，提示了Wnt通路在其中的作用。首先，他們在研究中沒有嚴格區分棕色脂肪和白色脂肪，后來的研究表明，這些能夠分化為起搏細胞的干細胞主要來源于棕色脂肪[53-54]；其次，這些研究都采用了甲基纖維素培養基，其相關機制并不清楚，有可能是培養基中的細胞因子和化學誘導劑對這種分化具有促進作用；最后，他們對跳動細胞的起搏特性研究較少涉及。2006年，Yamada等[55]最早從小鼠棕色脂肪組織中分離出CD29+干細胞，在常規培養條件下（不用甲基纖維素培養基）獲得了部分自發跳動的心肌樣細胞，認為棕色脂肪組織中存在著心肌定向分化祖細胞。后來該小組又發現，BASCs中CD133+的細胞在體外向心肌分化的比例最高，可以達到50%[56]。Liu等[57]改進了分離細胞的方法，提高了跳動的心肌樣細胞的比例。但三者都未對跳動心肌細胞的起搏特性進行研究。2009年，Takahashi等[58]利用BASCs源性的起搏細胞治療小鼠房室傳導阻滯，50%的小鼠傳導阻滯得到改善。Jumabay等[59]在對小鼠的去分化脂肪細胞給予20%胎牛血清培養14 d后，發現細胞表達心肌表面標志，其中一些為自發跳動的心肌樣細胞，并且具有4期自動除極化的特點，證實了自發跳動的心肌細胞具有起搏細胞的特性。本實驗室的前期工作也已證明了來自小鼠的棕色脂肪源性干細胞和去分化脂肪細胞，在體外可以定向分化為自發跳動的心肌細胞，并進一步證實了脂肪源性干細胞分化成的自發跳動的心肌細胞具有起搏細胞特征[60-61]。因此，雖然還有很多問題要解決，但ADSCs細胞極有可能成為理想的生物起搏器的種子細胞來源之一。

2.3 誘導性多能干細胞

自從2006年Takahashi等[62]報道了關于誘導性多能干細胞 （Induced pluripotent stem cells，iPS）的研究成果以來，iPS迅速成為干細胞領域的研究熱點。在干細胞源性的心肌中，存在著一些細胞具有竇房結細胞的特征[63]，但這種細胞的比例較少，甚至是一過性的[64]。Ma等[65]用心臟MYH6啟動子從iPS源性心肌細胞中篩選出殺稻瘟素（Blasticidin）抗性的高純度心肌細胞，可借鑒到起搏細胞的提純中。Semmler等[66]將未分化轉錄因子1（Undifferentiated transcription factor 1，UTF1）作為啟動子，從鼠iPS源性心肌細胞中得到了以表達HCN、產生If為主的細胞群。Mandel等[67]通過hESC和iPSC源性的心肌細胞進行了15 d細胞外電生理學觀察，發現其跳動頻率非常穩定，適合作為生物心臟起搏器的種子細胞。

3 問題與展望

生物心臟起搏器的研究雖已近20年，但面臨的困難還有很多。其中，細胞移植存在以下問題：移植細胞容易彌散，難以與周圍細胞形成連接導致重建或修復功能下降；移植部位及移植數量的選擇，也會影響重建、修復的起搏或傳導功能的正常發揮。相比之下，組織工程構建生物起搏器成為一個較為理想的選擇。構建一個起搏或傳導組織植入體內發揮作用，涉及到種子細胞與材料的相互作用。三維材料載體攜帶細胞進入體內能夠克服細胞移植的諸多缺陷。很多研究表明，組織工程方法可明顯改善細胞移植產生的問題。機體細胞所處的微環境對該細胞生理功能的發揮起著重要的作用。因此，深入探討起搏細胞所處的微環境，包括細胞外基質（ECM）、支持細胞、可溶性物質（細胞因子、生長因子等）對起搏細胞功能或傳導功能的影響也很重要。此外，生物心臟起搏器的成功構建還依賴于對竇房結等起搏、傳導結構調控機制的闡明。相信隨著研究的不斷深入和生物技術的不斷發展，生物心臟起搏器必將取代電子起搏器而應用于臨床。

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Advances of Seed Cells for Constructing Biological Pacemaker

JI Ruijuan,YANG Xiangqun.Research Center of Regenerative Medicine,Department of Human Anatomy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China. Corresponding author:YANG Xiangqun(E-mail:yangxq@smmu.edu.cn).

【Summary】 With the rapid development of stem cells,tissue engineering and regenerative medicine,cell transplantation and tissue engineering to construct biological pacemaker are expected to become the future direction.It is very crucial to find the ideal seed cells.Nowadays,the seed cells used for constructing the biological pacemaker includes:adult cells and stem cells.In this paper,the advances of seed cells for constructing biological pacemaker were reviewed.

Biological pacemaker;Adult cells;Stem cells

R318.11

B

1673－0364（2015）06－0381－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.06.010

2015年9月20日；

2015年11月8日）

國家自然科學基金（31170934）。

200433 上海市 第二軍醫大學解剖學教研室再生醫學研究中心。

楊向群（E-mail：yangxq@smmu.edu.cn）。