CELⅠ酶對提高基因合成正確率的影響

郝愛平

摘要：利用CEL I核酸內切酶能切割掉異源雙鏈DNA分子中錯配的單核苷酸堿基對的特性，研究了CEL I核酸內切酶是否能提高基因合成的正確率。結果表明，CEL I核酸內切酶不僅能切割掉雙鏈DNA分子中錯配的單核苷酸堿基對，同時也能引入外源堿基對，使合成的目的雙鏈DNA分子中錯誤率增加，不能達到提高基因合成正確率的目的。

關鍵詞：CEL I酶；雙鏈DNA分子；基因合成正確率

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5562-03

CELI酶是Oleykowski等[1]在1998年發現的一種單鏈特異性核酸酶（Single-strand specific nuclease），該酶能較好地識別異源雙鏈DNA分子中錯配的堿基對，屬于胞內酶的一種[2]，其等電點為6.0～6.5，分子質量為43 ku，催化活性需Mg2+和Zn2+的共同參與完成[3]。這類酶如S1核酸酶和綠豆核酸酶在20多年前就已廣泛應用于切割雙鏈DNA分子中的末端單鏈懸突，這兩種酶具有相同的關鍵殘基和類似的結構，但是在切割單核苷酸堿基對時表現出較大的差異[4，5]。早期研究表明，這類酶可以切割雙鏈DNA分子中的錯配位點，但是之后的研究表明這種切割是不可行的[2，6-8]。

CEL I酶是目前生物界發現的惟一能準確切割異源雙鏈DNA中存在錯配位點的酶[9]。CEL I酶在切割雙鏈DNA時除了會切割掉錯配的堿基對以外，究竟會不會對雙鏈DNA產生其他影響尚不得而知，能否將此酶應用于大規模生產中優化PCR環節，目前尚無確切相關的試驗證據。因此，本研究通過探討CEL I酶對基因合成正確率的影響，以達到減少基因合成錯誤率、降低生產成本、優化整個生產流程的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用基因引物及試劑由金唯智（蘇州）生物科技有限公司提供；CEL I酶試劑盒購自美國環球基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GC百分含量、片段大小，利用PRIMER軟件分析發卡結構和破壞發卡結構所需的能量，設計適當的首尾引物，每條基因引物長度在30 bp左右。將基因引物限制在每組2～16條之間。本試驗分為4組，每組基因全長都在800～900 bp之間（試驗最終得到的測序結果所需的測序軟件可信程度在800 bp左右）。

1.2.2 拼接中間片段 第一輪PCR反應體系設為：dNTPs（10 mmol/L）1 μL，5×Tap Buffer 10 μL，pfu DNA聚合酶0.5 μL，基因引物混合物10 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應程序為：95℃預變性5 min； 95 ℃變性30 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，20個循環；72 ℃終延伸7 min。

1.2.3 拼接全長基因 以拼接好的中間片段作為模板，第二輪PCR反應體系為：dNTPs （10 mmol/L）1μL，5×Tap Buffer 10 μL，pfu DNA聚合酶 0.5μL，中間片段模板2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性30 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，25個循環；72 ℃終延伸7 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳進行純化，得到全長基因產物。

1.2.4 CEL I酶切全長基因 利用CEL I酶對全長基因進行酶切，酶切體系為：全長基因18 μL，MgCl2（0.15 mmol/L）1.8 μL，Enhancer 1 μL， CEL I酶1 μL， 42 ℃保溫1 h之后，再加入Stop solution 2.2 μL。

1.2.5 拼接經CEL I酶剪切后的全長基因 將未經CEL I酶剪切修復的全長基因和經CEL I酶剪切已修復后的全長基因各取2 μL進行電泳檢測。如果檢測發現CEL I酶切前后產物都已擴增出，則進行下一步試驗，如發現未擴增出，則需重新擴增。再取2 μL已檢測到的CEL I酶切修復后產物進行PCR擴增。反應體系和條件都與拼接全長基因時相同，得到最終CEL I酶切修復后的全長基因產物。

1.2.6 測序分析 將得到的CEL I酶切后的全長基因產物經連轉、菌檢后進行測序，測序結果采用Seqman軟件進行分析對比。

2 結果與分析

2.1 電泳檢測結果分析

電泳檢測第一組CEL I酶切基因前與酶切后結果見圖1。從圖1可以看出，經CEL I酶剪切修復前的全長基因電泳圖比經CEL I酶剪切修復后的全長基因電泳圖亮度強，并且剪切修復前基因大于剪切修復后基因長度，造成這種情況可能是CEL I酶剪掉了全長基因中錯配的堿基對。

2.2 測序結果分析

將測序結果與標準序列用Seqman軟件進行比對分析，結果見表1。經過CEL I酶修復的10條全長基因中有4條（T61070、T60782、T60854、T60856）是完全正確的，另外6條分別有不同情況的缺失和突變。在T61071基因序列中487-522位點全部缺失，可能是CEL I酶將這部分剪掉了；而在基因序列T61072中469-486位點正確的序列被替換成錯誤的序列，553位點插入外源錯誤序列，這可能是CEL I酶把原來錯配的堿基剪掉，又引入了外源錯誤序列。

結果表明，CEL I核酸內切酶不僅能切割掉雙鏈DNA分子中錯配的單核苷酸堿基對，同時也能引入外源錯誤堿基對。

3 小結與討論

CELI酶被廣泛應用于探討基因多態性和基因功能的關系、人類疾病的個性化診斷、分子標記輔助育種等研究。而運用CEL I酶結合L-ICORDNA序列分析儀（L-ICOR，USA）或ABI遺傳分析儀（Applied biosystem，USA）開發出的Tilling和Ecotilling技術，可以發現大量基因組序列中存在的點突變，許多科學家已將這種技術作為研究反向遺傳學中探討基因功能問題的常用方法之一，并在多種不同動植物突變群體和自然群體多態性的研究工作中取得了較好的成績[10-13]。CEL I酶是Tilling和Ecotilling技術的關鍵酶，許多研究只是證實該酶具有在堿基錯配處切割異源雙鏈的活性，并未探討該酶對雙鏈DNA以及基因合成的影響[14，15]。endprint

本研究證實CEL I酶可能會剪掉全長基因中錯配的堿基對，也可能剪掉正確的堿基對，還可能在剪掉錯配堿基對的同時引入了外源堿基對，所以不能用CEL I酶來提高生產中PCR程序擴增全長基因的正確率。

參考文獻：

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[15] 田 暢， 王 楓，蔣 倩，等.芹菜核酸內切酶CELI基因的克隆及其表達分析[J].南京農業大學學報，2014，37（4）：39-45.

（責任編輯 屠 晶）endprint

本研究證實CEL I酶可能會剪掉全長基因中錯配的堿基對，也可能剪掉正確的堿基對，還可能在剪掉錯配堿基對的同時引入了外源堿基對，所以不能用CEL I酶來提高生產中PCR程序擴增全長基因的正確率。

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本研究證實CEL I酶可能會剪掉全長基因中錯配的堿基對，也可能剪掉正確的堿基對，還可能在剪掉錯配堿基對的同時引入了外源堿基對，所以不能用CEL I酶來提高生產中PCR程序擴增全長基因的正確率。

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