寧夏馬鈴薯Y病毒（PVY）外殼蛋白基因分子變異分析

陳曉軍　樊云芳　王敬東　等

摘要：馬鈴薯（Solanum tuberosum）Y病毒（Potato virus Y， PVY）是危害我國(guó)馬鈴薯的主要病毒之一。利用馬鈴薯Y病毒通用ELISA試劑盒確定所攜帶Y病毒的試驗(yàn)材料，設(shè)計(jì)了特異性引物通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得PVY CP基因序列，通過(guò)克隆PVY衣殼蛋白基因（Coat protein， CP）序列分析其進(jìn)化與變異類(lèi)型。結(jié)果表明，分離得到11株病毒，依據(jù)其CP序列特性分為4類(lèi)；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類(lèi)型為PVYO進(jìn)化分枝，同時(shí)也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒分離株的9.1%。結(jié)果揭示了寧夏地區(qū)PVY的進(jìn)化與變異類(lèi)型，有助于針對(duì)性地防控PVY。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯（Solanum tuberosum）；馬鈴薯Y病毒；分子變異

中圖分類(lèi)號(hào)：S532 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）22-5558-04

馬鈴薯（Solanum tuberosum）Y病毒（Potato virus Y， PVY）在世界各地均有報(bào)道，其能侵染34個(gè)屬170余種植物，但主要以茄科作物為主[1]。PVY是危害我國(guó)馬鈴薯的主要病毒之一[2]。PVY包括3個(gè)株系組：馬鈴薯Y病毒普通株系組（PVYO）、馬鈴薯點(diǎn)條斑株系（PVYc）、馬鈴薯Y病毒褐脈株系（PVYN）[3]。PVY染病植株25 ℃時(shí)其體內(nèi)病毒濃度最高，有利于該病的發(fā)生；30 ℃時(shí)染病植株體內(nèi)病毒濃度最低，表現(xiàn)為隱癥。PVYO和PVYC初期感染癥狀主要是葉片壞死和斑駁；PVYN則導(dǎo)致不同程度的花葉。PVYO和PVYC繼發(fā)侵染的植株表現(xiàn)出矮化、皺縮、斑駁和卷曲等癥狀；而PVYN感染植株通常為花葉和斑駁，當(dāng)溫度低于10 ℃和高于25 ℃時(shí)，不表現(xiàn)花葉癥狀。PVY通常不引發(fā)塊莖病癥，但近年來(lái)在歐洲出現(xiàn)PVYN中的一個(gè)株系PVYNTN，PVYNTN株系具有PVYN株系的血清型，在煙草和馬鈴薯地上部分引起的癥狀與PVYN株系相似。同時(shí)PVYNTN株系還可引起馬鈴薯塊莖壞死、環(huán)斑病，在塊莖的內(nèi)部或外部引起環(huán)狀、弧狀壞死斑，嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。

血清學(xué)方法最常用于PVY株系的鑒定，但單純的血清學(xué)關(guān)系已被證明不完全可靠，因?yàn)樵S多病毒編碼的蛋白質(zhì)都有高度保守的區(qū)域，即使親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的病毒在這些保守區(qū)域序列也可能相近，導(dǎo)致血清學(xué)反應(yīng)難以區(qū)分。近年來(lái)，隨著基因測(cè)序技術(shù)的成熟，大量病毒衣殼蛋白（Coating Protein，CP）基因的序列被測(cè)定，而且測(cè)定了不少病毒的全序列。CP基因序列分析在一定程度上對(duì)闡明PVY分類(lèi)具有一定的參考作用[4，5]。

RNA植物病毒的遺傳多樣性主要由突變、重組、重排等因素造成[6-8]，以快速適應(yīng)多變的生存環(huán)境。PVY突變頻率較高、重組頻繁，造成遺傳多樣性變化很大，因此能在不同寄主和不同環(huán)境中生存與傳播。研究病毒變異和進(jìn)化有助于了解病毒的起源、進(jìn)化機(jī)制、分類(lèi)關(guān)系和種群遺傳結(jié)構(gòu)的形成。本研究對(duì)寧夏地區(qū)流行的馬鈴薯Y病毒CP基因進(jìn)行測(cè)序，研究其分子變異，有助于掌握該病毒的變異類(lèi)型與流行區(qū)域，從而更為有效地防控該病毒的大面積流行。

1 材料與方法

1.1 材料

2011年，在寧夏固原農(nóng)業(yè)推廣總站馬鈴薯種質(zhì)資源圃中，收集195份疑似攜帶馬鈴薯Y病毒樣本。該資源圃中種植了目前全區(qū)大多數(shù)主栽馬鈴薯品種，選擇有病理癥狀明顯，從植株的頂部、中部和底部各取一片葉子合在一起，帶回實(shí)驗(yàn)室-70 ℃低溫保存。

1.2 試劑

馬鈴薯Y病毒通用ELISA試劑盒購(gòu)于安德珍生物公司；SV Total RNA Isolation System RNA提取試盒、mProm-II Reverse Transcriptase RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于Promega公司；Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000 plus購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 馬鈴薯Y的鑒定 稱(chēng)取0.10～0.15 g馬鈴薯病葉樣品放置于樣品袋中，并標(biāo)記；然后向樣品袋中加入1.0～1.5 mL試劑盒提取緩沖液，將樣品充分研磨；將樣品袋中的溶液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，4 000 r/min離心3 min，取上清液備用。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（DAS-ELISA）鑒定馬鈴薯病葉樣品，在典型陽(yáng)性植株中根據(jù)顯色吸光度由高到低選取11株備用。

1.3.2 馬鈴薯總RNA的提取 采用SV Total RNA Isolation System試劑盒提取樣品總RNA，然后保存于-70 ℃超低溫冰箱備用。

1.3.3 引物設(shè)計(jì) 從GenBank中獲得PVY CP基因核苷酸序列（HQ631374.1、AY601680.1、HM036202.1），并利用BLAST和Clustal軟件進(jìn)行保守性分析，上游引物序列PVY_CPF：5′-GGAAATGACACAATCGATGCAGG-3′和下游引物序列PVY_CPR：5′-CATGTTCTTGACTCCAAGTAGAG-3′。

1.3.4 RT-PCR擴(kuò)增PVY CP基因 取2 μg馬鈴薯總RNA，以O(shè)ligo dT為引物，進(jìn)行總cDNA反轉(zhuǎn)錄。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板PCR擴(kuò)增PVY CP基因。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，Pfu高保真聚合酶（5 U/μL）1 μL，總cDNA模版（1 μg/μL）1 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送天根生化科技（北京）有限公司進(jìn)行測(cè)序。endprint

1.3.5 PVY CP基因序列分析 對(duì)PVY CP基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，DNAMAN7.0進(jìn)行生物信息學(xué)分析。進(jìn)化樹(shù)采用MEGA軟件繪制，計(jì)算方法采用Neighbor-joining方法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVY陽(yáng)性植株的鑒定

經(jīng)PVY通用ELISA試劑盒鑒定的陽(yáng)性植株分別編號(hào)為PVY14，PVY24，PVY29，PVY31，PVY35，PVY36，PVY47，PVY58，PVY59，PVY60，PVY63。

2.2 PVY CP基因的克隆

利用RNA提取試劑盒提取陽(yáng)性馬鈴薯植株葉片總RNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，泳道1、2均為PVY陽(yáng)性植株。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，以反轉(zhuǎn)錄為模板進(jìn)行PVY CP基因的RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，11個(gè)樣品擴(kuò)增出了801 bp的目標(biāo)片段，與預(yù)期大小一致，表明成功擴(kuò)增出了CP基因。

2.3 PVY CP基因的生物信息學(xué)分析

11個(gè)樣品PVY分離株 CP基因的序列與GenBank 上已公布的PVY 不同分離株CP基因序列核苷酸序列同源性均在89.5%以上（表1）。其中，PVY59、PVY63與PVYNTN-NW株系的一致性達(dá)99.4%。根據(jù)Potyvirus 病毒劃分種的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)CP基因的核苷酸序列一致性高于76%時(shí)，應(yīng)歸為同一個(gè)種。因此，11個(gè)分離株應(yīng)為PVY分離株。

11個(gè)分離株中其核苷酸序列一致性為98.82%，共計(jì)57個(gè)位置堿基發(fā)生了變化，且多為同義突變即編碼的氨基酸序列沒(méi)有發(fā)生變化，編碼267個(gè)氨基酸序列，造成16個(gè)氨基酸序列存在變異（圖3）。

該地區(qū)PVY的親緣關(guān)系見(jiàn)圖4。由圖4可知，11個(gè)分離株可分為4類(lèi)。第一類(lèi)PVY29、PVY31、PVY58、PVY24、PVY47、PVY36屬于PVYN：O株系，與高芳鑾等[10]鑒定的14個(gè)不同省份PVY分離株（圖4中藍(lán)色框標(biāo)識(shí)部分）聚類(lèi)到一起，但是明顯具有一定的區(qū)域性。這說(shuō)明在本地區(qū)馬鈴薯長(zhǎng)期種植過(guò)程中，PVY病毒進(jìn)化有別于其他省份分離得到的病毒株系，發(fā)展成為較新的一類(lèi)型。第二類(lèi)PVY14、PVY59、PVY63屬于PVYNTN-NW株系，與第一類(lèi)同屬于PVY O型這一進(jìn)化分枝；第三類(lèi)PVY60，介于PVY O型化分枝和C型化分枝之間。第四類(lèi)PVY35，與本次分離得到的其他株系關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性?xún)H為93%，因此，將此分離株CP基因序列注冊(cè)GenBank，登入號(hào)為JN635310.1，與PVYNTN株系親緣關(guān)系較近，可能是一種新的PVYNTN株系變種。

2.4 寧夏地區(qū)PVY類(lèi)型分析

在核苷酸水平根據(jù)PVY CP基因第50位和86位核苷酸是A與否，可將PVY35分離株確定為PVYN型或PVYNTN型，其余分離株為PVYo型[2]。在蛋白質(zhì)水平，根據(jù)PVY CP蛋白第98和99位氨基酸為QL大多屬于PVYNTN型，為RM大多屬于PVYo[11]。分離株P(guān)VY35可能為PVYNTN型，其余分離株屬于PVY O型進(jìn)化分枝。據(jù)此，推測(cè)寧夏地區(qū)主要流行的病毒類(lèi)型為PVY O型進(jìn)化分枝，分屬于PVYNTN、PVYNTN-NW和PVYO 3種病毒類(lèi)型，占調(diào)查總數(shù)的90.9%（10/11），但是也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占調(diào)查總數(shù)的9.1%（1/11）。

3 小結(jié)與討論

PVY不同株系間可能具有相同的血清型或生物學(xué)特性，單獨(dú)利用免疫學(xué)技術(shù)和接種鑒別寄主等方法均無(wú)法對(duì)各株系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。以PCR為主要手段的分子檢測(cè)能很核苷酸水平準(zhǔn)確檢測(cè)其基因型，這對(duì)快速掌握和防控PVY流行趨勢(shì)具有一定的指導(dǎo)意義。本研究設(shè)計(jì)的引物為擴(kuò)增PVY CP基因全長(zhǎng)序列，其能提供更多的分型位點(diǎn)，在一定程度上彌補(bǔ)了血清學(xué)檢測(cè)的不足。通過(guò)PVY通用型ELSIA試劑盒對(duì)寧夏地區(qū)馬鈴薯疑似病株進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出11株P(guān)VY分離株，對(duì)這些病毒的衣殼蛋白基因進(jìn)行測(cè)序，可以劃分為4個(gè)類(lèi)型；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類(lèi)型為PVYo，但也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒的9.1%。

近20年來(lái)，很多人在全球范圍研究PVY在馬鈴薯中的傳播和重組。在歐洲，PVYNTN和PVYN-Wi型已經(jīng)替代了PVYO和PVYN；在美國(guó)和加拿大，PVYO仍然是主要流行病型，PVYN較少，但是重組型有增長(zhǎng)的趨勢(shì)并偶有分布。高芳鑾等[10]對(duì)中國(guó)PVY病毒進(jìn)行了CP基因變異研究，但沒(méi)有寧夏地區(qū)病株材料。本研究中，在寧夏地區(qū)195份疑似病株中僅檢測(cè)出PVY病毒11株，僅占整個(gè)檢測(cè)材料的5.64%，這個(gè)原因可能是由于多病毒復(fù)合感染，造成類(lèi)似表型。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張 帥.我國(guó)主要煙區(qū)PVY株系分化研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，2010.

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[3] 劉金亮，四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的分子變異及HC-Pro結(jié)構(gòu)對(duì)抑制RNA沉默的影響[D]，山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[4] 江 彤，陳 偉.來(lái)自安徽不同寄主PVY分離物的血清學(xué)鑒定及其cp基因分子進(jìn)化分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（5）： 540-543.

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[11] KARASEV，A V，HU X，BROWN C，et al. Genetic diversity of the ordinary strain of potato virus Y（PVY） and origin of recombinant PVY strains[J]. Phytopathology，2011，101（7）：778-785.

（責(zé)任編輯 屠 晶）endprint

1.3.5 PVY CP基因序列分析 對(duì)PVY CP基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，DNAMAN7.0進(jìn)行生物信息學(xué)分析。進(jìn)化樹(shù)采用MEGA軟件繪制，計(jì)算方法采用Neighbor-joining方法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVY陽(yáng)性植株的鑒定

經(jīng)PVY通用ELISA試劑盒鑒定的陽(yáng)性植株分別編號(hào)為PVY14，PVY24，PVY29，PVY31，PVY35，PVY36，PVY47，PVY58，PVY59，PVY60，PVY63。

2.2 PVY CP基因的克隆

利用RNA提取試劑盒提取陽(yáng)性馬鈴薯植株葉片總RNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，泳道1、2均為PVY陽(yáng)性植株。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，以反轉(zhuǎn)錄為模板進(jìn)行PVY CP基因的RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，11個(gè)樣品擴(kuò)增出了801 bp的目標(biāo)片段，與預(yù)期大小一致，表明成功擴(kuò)增出了CP基因。

2.3 PVY CP基因的生物信息學(xué)分析

11個(gè)樣品PVY分離株 CP基因的序列與GenBank 上已公布的PVY 不同分離株CP基因序列核苷酸序列同源性均在89.5%以上（表1）。其中，PVY59、PVY63與PVYNTN-NW株系的一致性達(dá)99.4%。根據(jù)Potyvirus 病毒劃分種的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)CP基因的核苷酸序列一致性高于76%時(shí)，應(yīng)歸為同一個(gè)種。因此，11個(gè)分離株應(yīng)為PVY分離株。

11個(gè)分離株中其核苷酸序列一致性為98.82%，共計(jì)57個(gè)位置堿基發(fā)生了變化，且多為同義突變即編碼的氨基酸序列沒(méi)有發(fā)生變化，編碼267個(gè)氨基酸序列，造成16個(gè)氨基酸序列存在變異（圖3）。

該地區(qū)PVY的親緣關(guān)系見(jiàn)圖4。由圖4可知，11個(gè)分離株可分為4類(lèi)。第一類(lèi)PVY29、PVY31、PVY58、PVY24、PVY47、PVY36屬于PVYN：O株系，與高芳鑾等[10]鑒定的14個(gè)不同省份PVY分離株（圖4中藍(lán)色框標(biāo)識(shí)部分）聚類(lèi)到一起，但是明顯具有一定的區(qū)域性。這說(shuō)明在本地區(qū)馬鈴薯長(zhǎng)期種植過(guò)程中，PVY病毒進(jìn)化有別于其他省份分離得到的病毒株系，發(fā)展成為較新的一類(lèi)型。第二類(lèi)PVY14、PVY59、PVY63屬于PVYNTN-NW株系，與第一類(lèi)同屬于PVY O型這一進(jìn)化分枝；第三類(lèi)PVY60，介于PVY O型化分枝和C型化分枝之間。第四類(lèi)PVY35，與本次分離得到的其他株系關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性?xún)H為93%，因此，將此分離株CP基因序列注冊(cè)GenBank，登入號(hào)為JN635310.1，與PVYNTN株系親緣關(guān)系較近，可能是一種新的PVYNTN株系變種。

2.4 寧夏地區(qū)PVY類(lèi)型分析

在核苷酸水平根據(jù)PVY CP基因第50位和86位核苷酸是A與否，可將PVY35分離株確定為PVYN型或PVYNTN型，其余分離株為PVYo型[2]。在蛋白質(zhì)水平，根據(jù)PVY CP蛋白第98和99位氨基酸為QL大多屬于PVYNTN型，為RM大多屬于PVYo[11]。分離株P(guān)VY35可能為PVYNTN型，其余分離株屬于PVY O型進(jìn)化分枝。據(jù)此，推測(cè)寧夏地區(qū)主要流行的病毒類(lèi)型為PVY O型進(jìn)化分枝，分屬于PVYNTN、PVYNTN-NW和PVYO 3種病毒類(lèi)型，占調(diào)查總數(shù)的90.9%（10/11），但是也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占調(diào)查總數(shù)的9.1%（1/11）。

3 小結(jié)與討論

PVY不同株系間可能具有相同的血清型或生物學(xué)特性，單獨(dú)利用免疫學(xué)技術(shù)和接種鑒別寄主等方法均無(wú)法對(duì)各株系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。以PCR為主要手段的分子檢測(cè)能很核苷酸水平準(zhǔn)確檢測(cè)其基因型，這對(duì)快速掌握和防控PVY流行趨勢(shì)具有一定的指導(dǎo)意義。本研究設(shè)計(jì)的引物為擴(kuò)增PVY CP基因全長(zhǎng)序列，其能提供更多的分型位點(diǎn)，在一定程度上彌補(bǔ)了血清學(xué)檢測(cè)的不足。通過(guò)PVY通用型ELSIA試劑盒對(duì)寧夏地區(qū)馬鈴薯疑似病株進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出11株P(guān)VY分離株，對(duì)這些病毒的衣殼蛋白基因進(jìn)行測(cè)序，可以劃分為4個(gè)類(lèi)型；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類(lèi)型為PVYo，但也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒的9.1%。

近20年來(lái)，很多人在全球范圍研究PVY在馬鈴薯中的傳播和重組。在歐洲，PVYNTN和PVYN-Wi型已經(jīng)替代了PVYO和PVYN；在美國(guó)和加拿大，PVYO仍然是主要流行病型，PVYN較少，但是重組型有增長(zhǎng)的趨勢(shì)并偶有分布。高芳鑾等[10]對(duì)中國(guó)PVY病毒進(jìn)行了CP基因變異研究，但沒(méi)有寧夏地區(qū)病株材料。本研究中，在寧夏地區(qū)195份疑似病株中僅檢測(cè)出PVY病毒11株，僅占整個(gè)檢測(cè)材料的5.64%，這個(gè)原因可能是由于多病毒復(fù)合感染，造成類(lèi)似表型。

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1.3.5 PVY CP基因序列分析 對(duì)PVY CP基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，DNAMAN7.0進(jìn)行生物信息學(xué)分析。進(jìn)化樹(shù)采用MEGA軟件繪制，計(jì)算方法采用Neighbor-joining方法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVY陽(yáng)性植株的鑒定

經(jīng)PVY通用ELISA試劑盒鑒定的陽(yáng)性植株分別編號(hào)為PVY14，PVY24，PVY29，PVY31，PVY35，PVY36，PVY47，PVY58，PVY59，PVY60，PVY63。

2.2 PVY CP基因的克隆

利用RNA提取試劑盒提取陽(yáng)性馬鈴薯植株葉片總RNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，泳道1、2均為PVY陽(yáng)性植株。以PVY_CPF、PVY_CPR為引物，以反轉(zhuǎn)錄為模板進(jìn)行PVY CP基因的RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，11個(gè)樣品擴(kuò)增出了801 bp的目標(biāo)片段，與預(yù)期大小一致，表明成功擴(kuò)增出了CP基因。

2.3 PVY CP基因的生物信息學(xué)分析

11個(gè)樣品PVY分離株 CP基因的序列與GenBank 上已公布的PVY 不同分離株CP基因序列核苷酸序列同源性均在89.5%以上（表1）。其中，PVY59、PVY63與PVYNTN-NW株系的一致性達(dá)99.4%。根據(jù)Potyvirus 病毒劃分種的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)CP基因的核苷酸序列一致性高于76%時(shí)，應(yīng)歸為同一個(gè)種。因此，11個(gè)分離株應(yīng)為PVY分離株。

11個(gè)分離株中其核苷酸序列一致性為98.82%，共計(jì)57個(gè)位置堿基發(fā)生了變化，且多為同義突變即編碼的氨基酸序列沒(méi)有發(fā)生變化，編碼267個(gè)氨基酸序列，造成16個(gè)氨基酸序列存在變異（圖3）。

該地區(qū)PVY的親緣關(guān)系見(jiàn)圖4。由圖4可知，11個(gè)分離株可分為4類(lèi)。第一類(lèi)PVY29、PVY31、PVY58、PVY24、PVY47、PVY36屬于PVYN：O株系，與高芳鑾等[10]鑒定的14個(gè)不同省份PVY分離株（圖4中藍(lán)色框標(biāo)識(shí)部分）聚類(lèi)到一起，但是明顯具有一定的區(qū)域性。這說(shuō)明在本地區(qū)馬鈴薯長(zhǎng)期種植過(guò)程中，PVY病毒進(jìn)化有別于其他省份分離得到的病毒株系，發(fā)展成為較新的一類(lèi)型。第二類(lèi)PVY14、PVY59、PVY63屬于PVYNTN-NW株系，與第一類(lèi)同屬于PVY O型這一進(jìn)化分枝；第三類(lèi)PVY60，介于PVY O型化分枝和C型化分枝之間。第四類(lèi)PVY35，與本次分離得到的其他株系關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性?xún)H為93%，因此，將此分離株CP基因序列注冊(cè)GenBank，登入號(hào)為JN635310.1，與PVYNTN株系親緣關(guān)系較近，可能是一種新的PVYNTN株系變種。

2.4 寧夏地區(qū)PVY類(lèi)型分析

在核苷酸水平根據(jù)PVY CP基因第50位和86位核苷酸是A與否，可將PVY35分離株確定為PVYN型或PVYNTN型，其余分離株為PVYo型[2]。在蛋白質(zhì)水平，根據(jù)PVY CP蛋白第98和99位氨基酸為QL大多屬于PVYNTN型，為RM大多屬于PVYo[11]。分離株P(guān)VY35可能為PVYNTN型，其余分離株屬于PVY O型進(jìn)化分枝。據(jù)此，推測(cè)寧夏地區(qū)主要流行的病毒類(lèi)型為PVY O型進(jìn)化分枝，分屬于PVYNTN、PVYNTN-NW和PVYO 3種病毒類(lèi)型，占調(diào)查總數(shù)的90.9%（10/11），但是也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占調(diào)查總數(shù)的9.1%（1/11）。

3 小結(jié)與討論

PVY不同株系間可能具有相同的血清型或生物學(xué)特性，單獨(dú)利用免疫學(xué)技術(shù)和接種鑒別寄主等方法均無(wú)法對(duì)各株系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。以PCR為主要手段的分子檢測(cè)能很核苷酸水平準(zhǔn)確檢測(cè)其基因型，這對(duì)快速掌握和防控PVY流行趨勢(shì)具有一定的指導(dǎo)意義。本研究設(shè)計(jì)的引物為擴(kuò)增PVY CP基因全長(zhǎng)序列，其能提供更多的分型位點(diǎn)，在一定程度上彌補(bǔ)了血清學(xué)檢測(cè)的不足。通過(guò)PVY通用型ELSIA試劑盒對(duì)寧夏地區(qū)馬鈴薯疑似病株進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出11株P(guān)VY分離株，對(duì)這些病毒的衣殼蛋白基因進(jìn)行測(cè)序，可以劃分為4個(gè)類(lèi)型；寧夏地區(qū)主要流行的病毒類(lèi)型為PVYo，但也可能出現(xiàn)了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被檢出病毒的9.1%。

近20年來(lái)，很多人在全球范圍研究PVY在馬鈴薯中的傳播和重組。在歐洲，PVYNTN和PVYN-Wi型已經(jīng)替代了PVYO和PVYN；在美國(guó)和加拿大，PVYO仍然是主要流行病型，PVYN較少，但是重組型有增長(zhǎng)的趨勢(shì)并偶有分布。高芳鑾等[10]對(duì)中國(guó)PVY病毒進(jìn)行了CP基因變異研究，但沒(méi)有寧夏地區(qū)病株材料。本研究中，在寧夏地區(qū)195份疑似病株中僅檢測(cè)出PVY病毒11株，僅占整個(gè)檢測(cè)材料的5.64%，這個(gè)原因可能是由于多病毒復(fù)合感染，造成類(lèi)似表型。

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