豬圓環病毒2型SYBR GreenⅠ熒光定量PCR診斷方法的建立

余波　周思旋　譚詩文　等

摘要：根據GenBank中豬圓環病毒2型ORF2基因序列設計特異性引物，PCR擴增獲得豬圓環病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應條件的優化，建立了豬圓環病毒2型的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法。擴增產物的溶解曲線分析只出現1個單特異峰，無引物二聚體，對PRV、PPV、E.coli、CSFV、PRRSV均無陽性信號，可重復性好，測靈敏度可達4.0×101拷貝/μL。結果表明，建立的豬圓環病毒2型SYBR Green I 實時熒光定量PCR具有特異、靈敏、快速、重復性好，適合于豬圓環病毒2型臨床樣品的檢測。

關鍵詞：豬圓環病毒2型；ORF2基因；SYBR Green I熒光定量PCR

中圖分類號：S854.4+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5474-04

豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2， PCV-2）主要導致斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）的發生，表現為免疫系統損傷，淋巴細胞減少、淋巴結腫大等病變，同時引起其他病原的繼發感染，目前已成為嚴重阻礙養豬業發展的主要病原之一[1-3]。目前檢測PCV-2主要有ELISA、膠體金、PCR等方法，但ELISA、膠體金主要用于檢測PCV-2抗體，且操作復雜、耗時長[4，5]。普通PCR不能進行定量分析，且靈敏度相對較低，無法檢測豬場的隱性感染。熒光定量PCR是與常規PCR比較，具有重復性好、靈敏度高、能夠定量等優點，已經被廣泛應用于多種疾病病原的檢測[6，7]。本研究根據GenBank中豬圓環病毒2型ORF2基因序列設計特異性的引物，利用PCR技術擴增獲得豬圓環病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應條件的優化，建立豬圓環病毒2型的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法，為豬圓環病毒2型臨床樣品的檢測提供科學的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：PCV-2、PRV閩-1株、PPV強毒株7909、CSFV、PRRSV、豬源大腸桿菌由貴州省畜禽疫病研究實驗室保存。

主要試劑及儀器：Goldview、Tris、EDTA、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相應10×Taq Buffer、dNTP、DH5α，pMD-18T、SYBR Green I熒光定量PCR酶等購自寶生物（大連）工程有限公司；TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。熒光定量PCR儀為Eppendorf Mastercycler ep realplex 4實時熒光定量PCR儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據ORF2 GenBank中豬圓環病毒2型ORF2基因序列設計1對特異性引物，上游引物：5′-GGAAGACCAATGTACACGTCATT-3′，下游引物：5′-GGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTC-3′，引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取

1）組織樣品：取待檢樣品淋巴結組織樣品共約0.5 g，加入500 μL PBS緩沖液，待檢樣品研磨后-70 ℃反復凍融3次，12 000 r/min離心取上清液用于核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取參照TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進行，將提取的DNA/RNA于-70 ℃保存。豬大腸桿菌參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行，將提取的DNA-20 ℃保存。

2）血清樣品：取50 μL血清加入等體積的血清裂解緩沖液（50 μmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 μmol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1%Triton×100，5%SDS），混勻后煮沸5 min，12 000 r/min離心取上清液2 μL用于熒光定量PCR和普通PCR。

1.2.3 pMD-18T-PCV2-ORF2陽性標準品的制備

用“1.2.1”中的引物，對PCV-2進行PCR擴增，反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環； 72 ℃ 10 min。將擴增的目的片段與pMD-18-克隆載體連接，轉化感受態細胞DH5α，重組體命名為pMD-18T-PCV2-ORF2，同時送寶生物工程（大連）有限公司測序。用紫外分光光度計測定測序正確的重組質粒pMD-18T-PCV2-ORF2在D260 nm/D280 nm處的吸光度，得到重組質粒的濃度和純度，進行10倍梯度倍比稀釋，作為陽性標準品。

1.2.4 熒光定量PCR反應條件的優化 熒光定量PCR反應在25 μL反應體系中進行，對熒光定量PCR反應條件，包括退火溫度（50、55、60 ℃）、引物濃度（5、10、20 μmol/L）進行優化以確定最佳反應條件。上下游引物（5、10、20 μmol/L）各1 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，模板1 μL，用超純水補足至25 μL，同時以去離子水作為空白對照。反應條件為：94 ℃ 10 s；94 ℃ 5 s、退火溫度（50、55、60 ℃）10 s、72 ℃10 s，40個循環。

1.2.5 熒光定量PCR反應標準曲線的建立 用紫外分光光度計測定測序正確的重組質粒pMD-18T-PCV2-ORF2，計算出重組質粒的濃度和純度，計算DNA拷貝數，隨后將標準陽性樣本進行連續10倍系列稀釋，以“1.2.4”的條件進行擴增，每個稀釋倍數3個重復，以拷貝數為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立標準曲線。

1.2.6 敏感性試驗 將重組質粒pMD-18T-PCV2-ORF2計算DNA拷貝數后，進行10倍比稀釋后分別進行熒光定量PCR反應，每個稀釋倍數3個重復，以確定建立的熒光定量PCR診斷的敏感性。

1.2.7 特異性試驗 以PCV-2、PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進行熒光定量PCR反應，每個樣品3個重復，以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性。

1.2.8 重復性試驗 應用建立的熒光定量PCR方法重復檢測PCV-2 DNA樣品3次，以檢驗結果的可靠性。

1.2.9 熒光定量PCR方法對臨床樣品的檢測 對2012～2013年貴州省貴陽市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區幾個生豬養殖場和養殖專業戶采集的75份疑似病料（組織），194頭份發病豬場未發病豬血清，應用建立的熒光定量PCR檢測方法進行檢測，同時應用文獻[8]中的方法進行普通PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 pMD-18T-PCV2-ORF2陽性標準品的制備

用“1.2.1”中的引物，對PCV-2進行PCR擴增，能有效擴增出目的片段，片段大小為105 bp，無非特異性片段產生（圖1）。將寶生物（大連）工程有限公司測序結果與GenBank中的PCV-2 ORF2基因序列比對，核苷酸相似度為98.9%～100%。

2.2 熒光定量PCR反應條件的優化

熒光定量PCR反應在25 μL反應體系中最佳反應條件為：退火溫度55 ℃，引物濃度10 μmol/L，能出現最高的熒光值、最小的Ct值，且在溶解曲線分析中不出現非特異性峰。

2.3 熒光定量PCR反應標準曲線的建立

將標準樣品10倍倍比稀釋，取4.0×107、4.0×106、4.0×105、4.0×104、4.0×103、4.0×102、4.0×101拷貝/μL 7種不同濃度重組質粒作為模板進行熒光定量PCR擴增反應，得到擴增反應的標準曲線（圖2），線性回歸方程為Ct=-2.894×lgcopies+32.89（R2=0.994）。

2.4 溶解曲線分析

在SYBR Green I熒光定量PCR結束后對擴增反應溶解曲線分析，結果見圖3。由圖3可見，擴增產物的溶解溫度Tm為84.0～84.4 ℃，沒有引物二聚體和非特異性產物等其他峰值出現。

2.5 敏感性試驗

將標準樣品倍比稀釋，取4.0×107、4.0×106、4.0×105、4.0×104、4.0×103、4.0×102、4.0×101、4.0×100拷貝/μL 8種不同濃度重組質粒作為模板進行熒光定量PCR擴增。由圖4可見，結果顯示其靈敏度為4.0×101拷貝/μL。

2.6 特異性試驗

由圖5可見，以PCV-2、PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進行熒光定量PCR反應，以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性。結果PCV-2為陽性，而PPV、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA為陰性。

2.7 重復性試驗

應用建立的熒光定量PCR方法重復檢測PCV-2 DNA樣品3次，以檢驗結果的可靠性，結果均一致。

2.8 熒光定量PCR對臨床樣品的檢測

對2012～2013年貴州省貴陽市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區幾個生豬養殖場和養殖專業戶75份疑似病料（組織）熒光定量PCR陽性率為29.3%（22/75），普通PCR陽性率為29.3%（22/75）。194頭份發病豬場未發病豬血清熒光定量PCR陽性率為9.2%（18/194），普通PCR陽性率為0%（0/194）。

3 小結與討論

目前利用PCR技術或者是血清學方法對豬場中的PCV-2感染情況進行檢測是控制PMWS的有效方法[9]。普通PCR在PCV-2的凈化中發揮了重要作用，但普通PCR檢測的靈敏度相對較低，主要用于組織病料的檢測，不能有效檢出豬群血清中PCV-2的隱形感染。陳蓉等[10]建立基于TaqMan探針的豬圓環病毒2型熒光定量PCR檢測方法，該方法的敏感性為6×101拷貝/μL，比普通PCR高2個數量級，對臨床樣本的陽性檢出率（64%）明顯高于普通PCR（44%）。曾思遙等[11]以豬圓環病毒2型核衣殼蛋白ORF2基因，設計合成特異性引物和探針，建立了PCV-2的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法，可達100拷貝/μL，可有效檢測出淋巴結、肺臟等組織中的PCV-2，但其未對感染豬場未發病豬血清進行檢測。

基于SYBR GreenⅠ的實時熒光定量PCR技術則無需探針，且價格較TaqMan探針低廉，雖然引物二聚體及非特異性擴增可能影響檢測結果的特異性，但可以通過融解曲線分析克服這一缺陷[12]。本研究根據豬圓環病毒2型ORF2基因序列設計特異性的引物，利用PCR技術擴增獲得豬圓環病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應條件的優化，建立了豬圓環病毒2型的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法，靈敏度可達4.0×101拷貝/μL，擴增產物的溶解溫度Tm為84.0～84.4℃，沒有引物二聚體和非特異性產物等其他峰值出現，適合于PCV-2臨床樣品的檢測。

本研究中75份疑似病死豬病料（組織）中病毒含量量較高，因此熒光定量PCR和普通PCR符合率為100%，而發病豬場未發病豬血清PRV病毒含量較低，普通PCR未檢測到血清中的病毒，而建立的實時熒光定量PCR能檢測到PCV-2 DNA。且本研究建立的血清中病毒提取方法，能夠快速的提取病毒DNA。因此，本研究建立的PCV-2 SYBR Green I 實時熒光定量PCR可應用于PCV-2早期感染和隱性感染檢測，有利于豬場PCV-2的凈化。

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（責任編輯 程碧軍）

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（責任編輯 程碧軍）

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