洪水對大凌河河流浮游細菌群落的影響

郭建國, 趙龍浩, 徐 丹, 孫野青

大連海事大學環境系統生物學研究所, 大連 116026

洪水對大凌河河流浮游細菌群落的影響

郭建國, 趙龍浩, 徐 丹, 孫野青*

大連海事大學環境系統生物學研究所, 大連 116026

洪水是一種突發性強、破壞力大的自然災害，它不僅造成巨大的經濟損失，而且對生態環境也有嚴重危害。在地球生物化學過程中起重要作用的微生物是否也受到影響值得深入研究。2012年采集了洪水暴發前后遼寧省錦州段大凌河表層水樣，利用DGGE技術，結合PCA和RDA分析研究了洪水對河流表層水中細菌群落的影響。結果表明：(1)洪水發生前后河流表層水中的細菌群落發生了改變:洪水發生前河流中細菌群落結構與河段所處的自然環境有很大的相關性，而洪水發生后這一現象消失。(2)洪水發生前，影響細菌群落結構的主要環境因素是pH和鹽度，而洪水發生后，影響細菌群落結構的主要環境因素是總磷。這一研究結果提示洪水通過改變河流表層水環境特性對其中的細菌群落進行重塑。

細菌群落; 洪水; DGGE; 表層水

洪水是由于氣候的原因導致局部地區大雨、暴雨或大范圍較長時間的霪雨天氣所致，它是人類生產生活以及社會經濟發展的威脅之一。洪水不僅造成大量房屋倒塌和農田被淹，危害到人民生命財產的安全，還對生態環境造成巨大的影響[1]。洪水可以造成嚴重的水土流失；可以攜帶大量泥沙、農藥殘留物以及工業廢渣等大量污染物進入河流[2]，使河道污染物總量增加；可以影響動植物棲息地的環境，而且影響動植物的生存和繁衍[3]；可以沖洗鹽堿化土壤表面的鹽堿，補充沼澤和湖泊的水量，改進植物的生長狀態和生物多樣性條件[1,4]。

微生物是地球上進行物質循環的生物地球化學過程的主力軍，微生物群落的構成直接影響它們的功能[5-6]。洪水作為一種水流運動的突發狀況，對河流是一種干擾，這種干擾是否會重塑河流中的微生物群落的組成？如果這種干擾可以改變微生物群落的結構，這種驅動因素是什么？2012年8月，受第10號臺風"達維"影響，遼寧省發生強降雨過程，發生了歷史罕見的洪災。大凌河是受影響嚴重的河流，本研究選取的研究區域位于錦州河口段，覆蓋約80km，河流寬度在2—30m，深度在0.5—3m。收集了洪水暴發前后大凌河表層水樣，研究洪水干擾對河流浮游細菌群落的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

圖1 采樣點分布圖

本研究的樣品于2012年5月和2012年8月采自遼寧省錦州段大凌河流域表層水，具體布點如圖1，本研究沿河流共設17個位點，采樣點多數位于郊區，由于當地各種改造工程的進行，有些位點只采集到1次，可參見表1。水樣經300目的無菌紗布過濾除去大型顆粒和雜質，取 300ml，用0.22um的硝酸纖維素膜過濾收集微生物于濾膜上，濾膜在-80℃冷凍保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 水樣理化因素的測定

溶解氧(DO)由溶氧儀雷磁GTB-607A測定，pH值由pH計雷磁THB-1測定，鹽度S由鹽度計測定，總氮量、氨氮含量、總磷量、磷酸鹽的測定參照《水質分析方法國家標準匯編》中提供的方法進行。

1.2.2 DNA的提取

將水樣濾膜從-80℃冰箱中取出，將濾紙剪碎后，利用CTAB法提取DNA[7]。利用Nanodrop對DNA的純度進行檢測。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

DNA的濃度進行定量后，以提取的水樣微生物DNA為模板，用引物對U968-GC-F(5′CGCCCGGGGCGCG-CCCCGGGCGGGGCGGGGGCAGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC3′)和L1401-R(5′CGGTGTGTACAAGACC-C3′)擴增16SrDNA的V6-V8區，擴增程序如下：94℃ 5min，(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)30 cycles，72℃ 10min,4℃保存。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，利用灰度分析將上樣量調整到400 ng，進行變性梯度凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%，變性濃度為45%—65%。電泳程序：120V 17h，60℃保溫。電泳結束后，進行硝酸銀染色，然后利用GS-800光密度掃描儀成像。

1.3 數據分析

DGGE圖譜利用Quantity one對主要條帶進行灰度分析，導出相應的灰度值矩陣。灰度值進行對數轉化后利用Canoco4.5對矩陣數據進行PCA分析，導出多樣性數據進行分析；結合環境監測數據進行RDA分析，分析結果進行蒙特卡羅檢驗，置換次數為999，可以顯著解釋響應變量的環境變量被選入模型。兩次采集水樣間環境因素經SPSS中單因素ANOVA進行均值的顯著性分析。

2 結果

2.1 洪水前后大凌河水樣微生物群落的相似性分析

將樣品根據位點的特征分為5個區域：R0-R4為河流的上游段；R5為工業排污口；R6，R7為河流下游段；R8，R9，R10為潮汐性淡水海水混合區；R10-R16為長期海水影響區，該區域在最小潮時仍然發生淡水海水的混合。

所有水樣16SrDNA擴增產物經變性梯度凝膠電泳后得到指紋圖譜，如圖2，條帶分離清晰，樣品間的主要微生物不同，河流中的浮游細菌群落結構存在差異。

圖2 兩次采集水樣的微生物16SrDNA的DGGE指紋圖

為了進一步理解這種差異，對2012年5月和2012年8月的樣品微生物群落組成進行了主成分分析(圖3)。2012年5月洪水發生前，大凌河表層水樣按照樣品采樣點的環境特征分開，環境特征相似的樣品的微生物群落結構相似(圖3)；2012年8月洪水發生后，除工業排污口與其他位點的微生物群落結構有巨大差異外，其余大凌河表層水樣散在分布(圖3)。以上研究表明洪水的發生改變了水流中的微生物群落結構。

圖3 兩次采集水樣微生物群落的PCA分析

圖4 兩次采集水樣細菌群落的多樣性分析

圖5 兩次采集水樣理化因素條形圖

對5個區域中的微生物群落多樣性進行了統計分析，表明在洪水發生前大凌河河流表層水中的微生物群落的香農指數H′有增加的趨勢，特別是在海水影響區，洪水發生后大凌河河流表層水中的微生物群落的多樣性指數有降低的趨勢，海水影響區在洪水發生前后多樣性指數差異顯著(P<0.05)(圖4)。對河流表層細菌群落的多樣性指數進行分析，洪水發生后微生物群落的多樣性指數均值由3.04降到2.84，變異系數由0.06升到0.11。

2.2 洪水前后大凌河水樣微生物群落與環境變量間的RDA分析

對各水樣的溶氧、pH值、鹽度、氨氮、總氮、磷酸鹽、總磷進行了測定(表1)。對兩次樣品的環境變量進行均值比較，統計學分析表明:pH、S存在極顯著性差異(P<0.01)，TP存在顯著性差異(P<0.05)，其他因素存在差異，但不顯著(圖5)。可見洪水的發生對于水流環境有很大的影響。

上述數據表明洪水發生前后，水環境發生了劇烈改變，而其中的微生物群落結構也發生了變化，那么水樣中哪些環境變量能夠解釋微生物群落的結構？本文利用RDA分析對這一問題進行了進一步研究。在洪水發生前，水流中微生物群落的結構主要受pH和S的影響，在洪水發生后，水流中的微生物群落主要受TP的影響(圖6)。

表1 兩次采集水樣的理化因素的測定

圖6 兩次采集水樣微生物群落和環境變量的RDA分析

3 結論與討論

微生物廣泛地存在于各種環境中，在生物地球化學過程中發揮著重要作用。微生物時刻受到各種自然壓力的選擇[8-9]。洪水作為一種劇烈的自然干擾對農業，畜牧業[10]及生態環境有很大的影響。NATHAN R. DE JAGER[11]發現隨著洪水的發生頻率和時間的增長，小樹種減少，耐受性物種規模增大。Chih-Ching Chung[12]發現長江洪災影響聚球藻屬在中國東海表層水中的生態分布。這些提示洪水可以對生態環境形成選擇壓力。

洪水發生前，PCA分析顯示水樣依據水流環境聚集在一起，分別為河流上游、排污口、河流下游、淡水海水混合區、海水影響區五類。有研究發現微生物群落的類型具有棲息地選擇性[13-14]。在洪水發生前，表層水中的微生物群落結構非常符合這一現象，也說明河流表層微生物群落在各自的棲息環境中進行進化，形成了環境依賴的特征。對這5個區域的微生物多樣性的趨勢分析也表明：洪水改變了微生物群落多樣性沿河流的升高的趨勢，與環境因素的改變和洪水的稀釋作用有關。RDA分析洪水發生前的環境因素對于表層水中微生物群落結構的解釋作用，發現pH和S是主要的環境解釋因素。pH和S是已研究的環境因素中對生物群落的形成具有非常重要的因子[15-17]。已有研究表明：土壤pH對濕地植物的分布具有很大的影響[18]，土壤微生物群落對pH變化敏感[19]，海洋的酸化過程會影響海洋微生物的多樣性[20]。在水生態系統中，鹽度可以控制微生物的分布[21-22]，形成明顯的淡水微生物群和海水微生物群。洪水發生前水流中微生物的解釋變量為pH和S，也進一步說明該河段表層水中微生物群落形成了環境依賴性的結構。

洪水發生后，河道水位急速上升，水量增大，環境數據顯示水流中的pH和S都明顯下降，這與洪水的稀釋作用有關，氨氮、總氮、磷酸鹽、總磷的濃度也發生變化。對河流表層微生物群落的PCA分析表明：微生物群落在洪水后各樣點根據河道自然環境特征聚集的特點消失，而是趨于散在分布。洪水流經農田，道路等將非土著性微生物帶入河道，而河流的稀釋導致原環境中微生物濃度的稀釋，在這種條件下微生物在改變的新環境中迅速建立起新的群落結構，這也就解釋了散在性分布的原因。從RDA分析的結果中發現，洪水后，影響微生物群落結構的主要解釋變量為TP。而河流表層水中的TP在洪水發生前后有顯著性差異。磷是浮游植物和細菌生長的必需元素，磷的缺失可以限制他們的生長[23]。磷是農田的主要肥料之一，突發洪水將大量農田中的磷元素帶入河流，從而促進了微生物群落的重塑。磷的富集是導致淡水和近海岸赤潮的發生的原因之一[24-25]。在一些富營養區海灣，磷是具有限制性的元素[26]，突發洪水可能將大量磷元素帶入，提高了風險。

結論：在自然條件下，河流表層水中的浮游細菌群落在各自的環境條件下進行進化，這種進化導致的結果與所處生態位的環境特征相關，當強烈的外界因素如洪水介入后，會改變河流固有的環境特征，特別是限制性元素磷的重新分布，從而對微生物群落造成重塑，重塑導致的微生物群落變化，會帶來未知的危害，如赤潮等災害的發生，本研究可以為淡水和近海岸災害的發生提供依據。

[1] 許士國, 黨連文, 牟志錄. 嫩江1998年特大洪水環境影響分析. 大連理工大學學報, 2003, 43(1): 114-118.

[2] W?lz J, Brack W, Moehlenkamp C, Claus E, Braunbeck T, Hollert H. Effect-directed analysis of Ah receptor-mediated activities caused by PAHs in suspended particulate matter sampled in flood events. Science of the Total Environment, 2010, 408(16): 3327-3333.

[3] 高宗強. 洪水對生態環境的影響. 山西水土保持科技, 2002, (2): 25-25, 26-26.

[4] Tan H Z, Luo Y J, Wen S W, Liu A Z, Li S Q, Yang T B, Sun Z Q. The effect of a disastrous flood on the quality of life in Dongting Lake area in China. Asia Pacific Journal of Public Health, 2004, 16(2): 126-132.

[5] Stahl D A, Flowers J J, Hullar M, Davidson S. Structure and function of microbial communities // The Prokaryotes. Berlin Heidelberg: Springer, 2013: 3-30.

[6] Nannipieri P, Ascher J, Ceccherini M T, Landi L, Pietramellara G, Renella G. Microbial diversity and soil functions. European Journal of Soil Science, 2003, 54(4): 655-670.

[7] Sambrook J, Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001：512-513.

[8] Dornelas M. Disturbance and change in biodiversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2010, 365(1558): 3719-3727.

[9] Stefano J D, York A. Relationships between disturbance regimes and biodiversity: background, issues and approaches for monitoring fire and adaptive management. Melbourne: The State of Victoria Department of Sustainability and Environment, 2012: 1-50.

[10] Inchaisri C, Supikulpong P, Vannametee E, Luengyosluechakul S, Khanda S, Tashnakajankorn T, Ajariyakhajorn K, Sasipreeyajan J, Techakumpu M. The effect of a catastrophic flood disaster on livestock farming in Nakhon Sawan province, Thailand. Tropical Animal Health and Production, 2013, 45(4): 917-922.

[11] De Jager N R. Effects of flood frequency and duration on the allometry of community-level stem size-density distributions in a floodplain forest. American Journal Botany, 2012, 99(9): 1572-1576.

[12] Chung C C, Huang C Y, Gong G C, Lin Y C. Influence of the Changjiang River Flood on synechococcus ecology in the surface waters of the East China Sea. Microbial Ecology, 2014, 67(2): 273-285.

[13] Pontarp M, Canback B, Tunlid A, Lundberg P. Phylogenetic analysis suggests that habitat filtering is structuring marine bacterial communities across the globe. Microbial Ecology, 2012, 64(1): 8-17.

[14] Wang J, Shen J, Wu Y C, Tu C, Soininen J, Stegen J C, He J Z, Liu X Q, Zhang L, Zhang E. Phylogenetic beta diversity in bacterial assemblages across ecosystems: deterministic versus stochastic processes. The Isme Journal, 2013, 7(7): 1310-1321.

[15] McCarthy S A. Effects of temperature and salinity on survival of toxigenic Vibrio cholerae O1 in seawater. Microbial Ecology, 1996, 31(2): 167-175.

[16] Belnap C P, Pan C, Denef V J, Samatova N F, Hettich R L, Banfield J F. Quantitative proteomic analyses of the response of acidophilic microbial communities to different pH conditions. The Isme Journal, 2011, 5(7): 1152-1161.

[17] Diouf D, Samba-Mbaye R, Lesueur D, Ba A T, Dreyfus B, De Lajudie P, Neyra M. Genetic diversity of Acacia seyal del. Rhizobial populations indigenous to senegalese soils in relation to salinity and pH of the sampling sites. Microbial Ecology, 2007, 54(3): 553-566.

[18] Shang W, Yang Y X. Degradation characteristics, patterns, and processes of lakeside wetland in Napahai of northwest Yunnan Plateau, Southwest China. Chinese Journal of Applied Ecology, 2012, 23(12): 3257-3265.

[19] Anderson J A H, Hooper M J, Zak J C, Cox S B. Molecular and functional assessment of bacterial community convergence in metal-amended soils. Microbial Ecology, 2009, 58(1): 10-22.

[20] Kroeker K J, Micheli F, Gambi M C, Martz T R. Divergent ecosystem responses within a benthic marine community to ocean acidification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(35): 14515-14520.

[21] Herlemann D P, Labrenz M, Jurgens K, Bertilsson S, Waniek J J, Andersson A F. Transitions in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of the Baltic Sea. The ISME Journal, 2011, 5(10): 1571-1579.

[22] Abed R M M, Kohls K, De Beer D. Effect of salinity changes on the bacterial diversity, photosynthesis and oxygen consumption of cyanobacterial mats from an intertidal flat of the Arabian Gulf. Environmental Microbiology, 2007, 9(6): 1384-1392.

[23] Zhou Q X, Gibson C E, Zhu Y M. Evaluation of phosphorus bioavailability in sediments of three contrasting lakes in China and the UK. Chemosphere, 2001, 42(2): 221-225.

[24] Godfrey P, Mitchell D. Eutrophication and phosphate detergents. Science, 1972, 177(4051): 816-817.

[25] Lee G F, Jones R A. Detergent phosphate bans and eutrophication. Environment Science& Technology, 1986, 20(4): 330-331.

[26] Qu L M, Yao D, Cong P F. Inorganic nitrogen and phosphate and potential eutrophication assessment in Liaodong bay. Environmental Science, 2006, 27(2): 263-267.

Effect of the flood on the bacterial community of bacteriaplankton in Daling River

GUO Jianguo, ZHAO Longhao, XU Dan, SUN Yeqing*

InstituteofEnvironmentalSystemsBiology,DalianMaritimeUniversity,Dalian116026,China

The flood often causes damage to human and the environment. In order to determine whether the flood can affect the bacterial community which plays an important role in the process of geobiochemistry, we collected the surface water samples along Daling River before and after the flood in 2012. We analyzed the bacterial community of the samples using DGGE, combined with statistic methods PCA and RDA. The results were as follows: (1) The flood had a great effect on the bacterial community of bacteriaplankton in the river. Before the flood occured, the PCA result showed that samples formed clusters according to their natural habitat types, while this relationship disppeared after the flood. (2)The bacterial community was primely shaped by pH and salinity which was determined in other studies as well before the flood, while the main explanatory environmental factor was total phosphorus after the flood. Therefore,we came to a conclusion that the flood can shape the bacterial community by the shift of the environmental characteristic such as total phosphorus.

bacterial community; flood; DGGE; surface water

國家科技支撐項目(2010BAC68B02); 大連市科技計劃項目(2011E11SF007)

2013-12-29;

2014-09-09

10.5846/stxb201312293053

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yqsun@dlmu.edu.cn

郭建國, 趙龍浩, 徐 丹, 孫野青.洪水對大凌河河流浮游細菌群落的影響.生態學報,2015,35(14):4777-4783.

Guo J G, Zhao L H, Xu D, Sun Y Q.Effect of the flood on the bacterial community of bacteriaplankton in Daling River.Acta Ecologica Sinica,2015,35(14):4777-4783.