長期施加氮肥及氧化鈣調節對酸性土壤硝化作用及氨氧化微生物的影響

張苗苗，王伯仁，李冬初，賀紀正，張麗梅,*

1 中國科學院生態環境研究中心, 北京 100085 2 中國科學院大學, 北京 100049 3 中國農業科學院農業部祁陽紅壤生態環境重點野外科學觀測試驗站, 永州 426100

長期施加氮肥及氧化鈣調節對酸性土壤硝化作用及氨氧化微生物的影響

張苗苗1,2，王伯仁3，李冬初3，賀紀正1，張麗梅1,*

1 中國科學院生態環境研究中心, 北京 100085 2 中國科學院大學, 北京 100049 3 中國農業科學院農業部祁陽紅壤生態環境重點野外科學觀測試驗站, 永州 426100

酸性土壤; 氧化鈣調節; 硝化作用; 氨氧化古菌(AOA); 氨氧化細菌(AOB)

酸性土壤(pH <5.5)在我國分布面積廣泛，是我國熱帶亞熱帶經濟作物如茶樹、林木、果樹和糧食作物的重要產地。近幾十年來，因化學氮肥的過量施用和酸沉降加劇，我國農田土壤的酸度逐步升高，面積也不斷增加[1]。為了緩解土壤酸化，農業中常采用田間施加化學改良劑(如石灰(CaO))的方法來進行改良，效果顯著[2-3]。

硝化作用是土壤氮素轉化的關鍵過程，除影響土壤中無機氮對植物的有效性外，硝化作用對酸性土壤進一步酸化、有毒金屬元素的溶解釋放等都有重要影響[1, 4-6]。氨氧化作用作為硝化作用的限速步驟，是全球氮循環的中心環節，主要由氨氧化細菌(AOB)[7]和古菌(AOA)[8-10]驅動。大量分子生態學調查發現，雖然多種環境因子，包括溫度、pH值、施肥、土壤類型及土地利用方式等都會影響兩類氨氧化微生物的群落組成和數量，但pH值是影響其分布及功能活性的決定性因子。已有研究發現，隨著pH值增加，AOA和AOB群落組成發生明顯演替，AOA的數量和amoA基因的表達活性顯著降低，AOB則呈相反趨勢[11-15]。2007年，對湖南祁陽紅壤長期定位實驗站連續16a施加不同化學肥料處理土壤中的氨氧化細菌和古菌的群落組成進行了調查，結果發現，長期施加無機氮肥顯著降低了AOA和AOB的數量，并改變了AOA的群落組成，但對AOB的群落結構無顯著影響，揭示了AOA可能在該酸性土壤硝化作用中起重要作用[16]。通過穩定性同位素探測技術(stable isotope probing, SIP)等的研究，也證實氨氧化古菌是一些酸性土壤硝化作用的主導者[17]。

以上研究揭示了氨氧化古菌對酸性土壤硝化作用的重要貢獻，然而在多數酸性土壤中也能檢測到數量相當的氨氧化細菌，但對這些酸性土壤中氨氧化細菌的存在有何生態學意義并不清楚。由于多年連續施肥，湖南祁陽紅壤定位施肥實驗站長期接受施化學氮肥處理的土壤pH值持續下降，土壤肥力和生產力嚴重受阻，該實驗站于2010年將原施氮肥(N)、氮鉀肥(NK)、氮磷肥(NP)、氮磷鉀肥(NPK)處理的小區劃分出一半進行添加氧化鈣處理，以期通過添加氧化鈣調節土壤pH值，改善土壤質量。本研究在2007年對該樣地土壤研究的基礎上，對持續施肥5a后以及添加CaO處理對土壤硝化作用和氨氧化細菌和古菌的影響進行了跟蹤研究，以期為進一步認識酸性土壤硝化作用過程及其機制提供參考，為農田施肥及酸性土壤改良管理方式提供指導依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本研究中的土壤樣品采集于湖南省祁陽紅壤定位施肥實驗站(26°45′N，111°52′E)，該地屬于典型的亞熱帶季風氣候，年平均氣溫18 ℃，年降水量1300 mm。本實驗共選擇了9個處理，包括1990年開始的長期施肥處理及2010年開始的施加氧化鈣(CaO)處理，具體情況如下：1)不施肥(Control)，2)氮肥(N)，3)氮鉀肥(NK)，4)氮磷肥(NP)，5)氮磷鉀肥(NPK)，6)氮肥加氧化鈣(N+CaO)，7)氮鉀肥加氧化鈣(NK+CaO)，8)氮磷肥加氧化鈣(NP+CaO)，9)氮磷鉀肥加氧化鈣(NPK+CaO)。肥料用量為年施用N 300 kg/hm2、P2O5120 kg/hm2、K2O 120 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O比值為1∶0.4∶0.4；氧化鈣年施用量為2550 kg/hm2。

樣品采集于2012年7月，所采樣品均為0—20 cm表層土壤。每個處理小區取3個重復，每個重復分別取5個點混合而成。樣品于低溫保存帶回實驗室后，剔除石礫和植物殘根等雜物，過2 mm篩處理，一部分保存于4 ℃冰箱用于土壤基本化學性質的測定，其余樣品放置于-80 ℃保存，用于分子生態學實驗分析。

1.2 土壤化學指標及硝化潛勢測定

1.3 土壤DNA提取

土壤DNA提取以MoBio PowerSoilTMDNA(MO BIO laboratories, CA, US))試劑盒進行提取，稱取0.25 g土壤按照試劑盒操作指南進行，并略加修改：細胞破碎在FastPrep上進行，破碎速度為5.0，時間為45 s。DNA提取后于-20 ℃保存待用，所有DNA均稀釋10倍用于下游實驗。

1.4 定量PCR分析

氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)定量PCR分析均采用SYBR Green法，反應在iCycle iQ5(Bio-Rad, USA)儀器上進行。 PCR反應體系為25 μL，包含12.5 μL 2 × SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa, Japan)，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，其余用ddH2O補足至25 μL[19]。定量PCR所用的擴增引物及反應條件見表1。

1.5 變性梯度凝膠電泳分析

氨氧化微生物的群落結構分析采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)法，DGGE在DCode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad, USA)中進行。AOAamoA基因PCR擴增體系為25 μL，其中包括12.5 μL 2 × Premix Ex TaqTM(TaKaRa, Japan),10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，其余用ddH2O補足至25 μL。AOBamoA基因擴增體系除10 μmol/L正反向引物用量為0.4 μL外，其余與AOAamoA反應體系相同。DGGE-PCR反應的擴增引物及反應條件如表1所示。DGGE電泳在6%聚丙烯酰胺膠中進行，AOAamoA基因所用的變性膠濃度范圍為10%—45%，電泳條件為90 V，12 h。AOBamoA基因變性膠濃度范圍為30%—55%，電泳條件為120 V，8 h。每個處理選取兩個重復進行DGGE分析。

1.6 統計分析

本研究中所有相關分析均采用Pearson相關分析；添加N與N+CaO、NK與NK+CaO、NP與NP+CaO、NPK與NPK+CaO各組處理間的差異性分析采用成對數據T檢驗分析；多組數據間的方差分析采用單因素方差分析ANOVA。所有統計檢驗均用SPSS 19實現，P<0.05即認為差異顯著。DGGE圖譜的聚類分析以Quantity One軟件讀取條帶后以UPGMA方法進行。

表1 定量PCR及DGGE-PCR中所用引物及反應程序

2 結果

2.1 土壤化學性質及硝化潛勢(PNR)

表2 土樣的基本化學性質及硝化潛勢(±標準誤差)

2.2 氨氧化微生物的豐度變化

圖1 不同氮肥處理及氧化鈣(CaO)調節處理土壤中氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)amoA基因豐度Fig.1 Abundance of archaeal and bacterial amoA gene in soils under different N fertilizers and CaO treatments±標準誤差；不同大寫字母表示AOA豐度在各處理之間的差異顯著性，不同小寫字母表示AOB豐度在各處理之間的差異顯著性

利用實時熒光定量PCR技術對各處理土壤中的氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的amoA基因豐度進行了分析，結果如圖1所示。成對數據T檢驗分析結果顯示，在所有未加CaO的處理中，AOAamoA基因的豐度均顯著高于AOB(P<0.05)，二者的比值為10.9—44.3。添加CaO后，AOA豐度在一定程度上降低，AOB豐度顯著增加(P<0.05)，使得AOA和AOB二者基因豐度相當，無顯著差異，其比值降低至0.83—1.94。在所有處理中，對照土壤AOA豐度最高(1.39×109copies/g)，N+CaO土壤AOA豐度最低(5.31×107copies/g)；NPK+CaO處理土壤中AOB豐度最高(2.42×108copies/g)，N肥處理土壤中AOB豐度最低(3.34×106copies/g)。另外，土壤硝化潛勢與土壤中AOA和AOBamoA基因豐度均無顯著相關關系，但與AOA和AOBamoA基因豐度之和，即土壤中總amoA基因豐度顯著正相關(r=0.40,P<0.05)。

2.3 氨氧化微生物的群落結構

氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的群落結構以PCR-DGGE方法進行分析，結果發現所有處理均容易獲得足量的AOA PCR產物用于DGGE電泳。DGGE圖譜及其對應條帶的聚類分析結果顯示，對照處理Ctrol與其它施肥處理明顯分開，單獨成為一支，表明對照處理Ctrol土壤中AOA的群落結構與其它處理存在明顯差異；所有施肥處理中，N處理與其它處理明顯分開，NP和NK，NPK+CaO和NPK，NK+CaO、NP+ CaO和N+CaO分別聚集成3個小分支(圖2)，表明AOA的群落組成在這3組處理中存在稍小差異。

圖2 不同土壤中氨氧化古菌amoA基因的DGGE圖譜及其UPGMA聚類分析Fig.2 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profiles and the UPGMA dendrogram of ammonia-oxidizing archaeal amoA gene in soils

而對AOB來說，施加CaO的所有處理均能獲得足夠的PCR產物進行DGGE電泳分析，但盡管使用同樣的PCR擴增條件，對照處理土壤Ctrol及各施氮肥處理土壤中AOBamoA基因PCR擴增產物較弱甚至擴增不出，在DGGE圖譜上僅得到一些隨機條帶；與不施加CaO的處理相比，施加CaO的所有處理中AOB的DGGE條帶明顯增加，并顯示出較高的群落相似性，表明施加CaO明顯刺激了這部分氨氧化細菌的生長；此外，NPK+CaO處理土壤比N+CaO，NK+CaO，NP+CaO處理顯示出更高的組成多樣性(圖3)。對DGGE圖譜進行的聚類分析的結果也顯示，施N肥處理及對照處理與其它處理明顯分開，其余處理聚積于一大分支，其中添加CaO的4個處理又聚積成一個小分支，且NPK+CaO處理與N+CaO，NK+CaO，NP+CaO相互分開(圖3)。

圖3 不同土壤中氨氧化細菌amoA基因DGGE圖譜及其UPGMA聚類分析Fig.3 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profiles and the UPGMA dendrogram of ammonia-oxidizing bacterial amoA gene in soils

3 討論

3.1 長期施肥處理及添加CaO對土壤性質和硝化作用的影響

3.2 氨氧化微生物對長期施氮肥及添加CaO的響應

在所有施肥處理土壤中，氨氧化古菌AOAamoA基因(7.40×107—4.08×108copies/g)的豐度均顯著高于氨氧化細菌AOB(1.67×106—2.57×107copies/g)，二者比值為10.9—44.3，這與2007年的調查結果一致，并與其他有關酸性土壤中AOA占主導優勢的研究結論相符[23-26]。已有的大量研究也表明，在大區域尺度上，pH值是驅動氨氧化微生物多樣性分布及活性的主要因子[12]。Nicol等[11]對pH值梯度為4.9—7.5的草地土壤進行的研究發現，AOA與AOB的數量比值隨pH值增加而降低，AOA的數量和amoA基因的表達活性隨土壤pH值增加明顯降低，而AOB則相反。作者及國內其他研究者利用高通量測序技術及穩定性同位素探測(SIP)等技術對我國一系列土壤開展的研究也發現，隨土壤pH值增加，AOA和AOB群落組成發生明顯演替；在北方堿性潮土中，氨氧化細菌是硝化作用的主要驅動者，而在南方酸性土壤中，硝化作用主要由氨氧化古菌所驅動[13, 17, 27-28]。這些結果一致證實了AOA和AOB生態位分異的特征，即AOB傾向于在高氮及pH值中性或堿性的環境中起主導作用，而AOA則傾向于在酸性及低氮高有機質的土壤中占主導優勢[29-32]。

此外，還發現，NPK及NPK+CaO土壤中AOB和AOA群落結構與其它處理土壤也有一定差異，這說明P、K也會影響土壤氮循環過程及氨氧化微生物，這與之前一些研究報道結果一致[36-37]。

4 結論

本研究對長期施加不同氮肥處理并添加CaO調節的酸性紅壤中硝化作用及氨氧化微生物的群落結構和豐度特征進行了研究，結果發現，連續施加含氮肥料可導致土壤pH值和硝化作用進一步降低，添加CaO則可緩解土壤酸化，顯著提高土壤pH值和硝化潛勢。AOA的群落組成在長期施肥處理與不施肥處理間有顯著不同，但在不同氮肥處理間無顯著差異。添加CaO處理對AOA的群落組成無顯著影響，但明顯提高了各施肥處理土壤中氨氧化細菌的豐度，并增加了其群落多樣性，氨氧化古菌的豐度受到一定程度的抑制。這些結果表明，雖然氨氧化古菌因自身的生理及遺傳特征更適應在酸性土壤硝化作用中發揮作用，酸性土壤中AOB在功能上冗余，但當添加CaO后，AOA和AOB對環境條件變化迅速作出響應，并根據其不同的生態位需求重新分配優勢地位，二者交替作用共同驅動著酸性土壤的硝化作用。

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Effects of long-term N fertilizer application and liming on nitrification and ammonia oxidizers in acidic soils

ZHANG Miaomiao1,2, WANG Boren3, LI Dongchu3, HE Jizheng1, ZHANG Limei1,*

1ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China3RedSoilExperimentalStation(Qiyang,Hunanprovince),theMinistryofAgriculture,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Yongzhou426100,China

acidic soils; liming; nitrification; ammonia-oxidizing archaea (AOA); ammonia-oxidizing bacteria (AOB)

國家自然科學基金資助項目(41171217, 41322007)

2014-02-26; < class="emphasis_bold">網絡出版日期:

日期:2014-12-04

10.5846/stxb201402260329

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhanglm@rcees.ac.cn

張苗苗，王伯仁，李冬初，賀紀正，張麗梅.長期施加氮肥及氧化鈣調節對酸性土壤硝化作用及氨氧化微生物的影響.生態學報,2015,35(19):6362-6370.

Zhang M M, Wang B R, Li D C, He J Z, Zhang L M.Effects of long-term N fertilizer application and liming on nitrification and ammonia oxidizers in acidic soils.Acta Ecologica Sinica,2015,35(19):6362-6370.