表面活性蛋白A 不同亞型在脂多糖誘導腎小管上皮細胞IL-8 表達中的作用

胡鳳琪 崔 龍 明 靜 袁 海

SP-A 是一種首先發現在肺泡Ⅱ型上皮細胞表達的凝集素，在調節肺天然免疫中發揮著重要作用，可識別和清除多種病原體，增強巨噬細胞及中性粒細胞的吞噬作用，還可通過作用于不同細胞表面受體調節多種炎癥因子的表達［1］。SP -A 蛋白包括兩個亞型:SP-A1 及SP -A2，本研究組先前的研究已經證實，SP-A 除在肺表達外，在腎臟中也有表達，主要分布于腎小管上皮細胞，且脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可誘導腎小管上皮細胞SP-A1 及SP-A2 的表達升高［2］。筆者進一步研究發現，SP -A/D 雙基因敲除小鼠在發生泌尿系感染時其白細胞介素-8(IL-8)分泌較野生型小鼠減少，但其作用機制尚不明確［3］。本研究探討SP - A 不同亞型對LPS 誘導的HK-2 細胞IL -8 表達的影響，進一步探討SP -A及其亞型在腎臟炎性反應調節中的作用。

材料與方法

1.材料:人近曲腎小管上皮細胞株HK -2 購自ATCC，DMEM/F12 培養液、胎牛血清購自美國Gibco 公司。LPS O111:B4 購自美國Sigma 公司。Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司;反轉錄試劑盒及SYBR Green 實時定量PCR 試劑盒購自日本TOYOBO 公司。人IL -8 ELISA 試劑盒購自美國RD 公司。

2.細胞培養與處理:HK-2 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養基中，待細胞達70%融合時，改用無血清培養基培養24h，使細胞同步化。采用1μg/ml 的LPS 刺激轉染及對照組HK-2 細胞8h 后檢測SP -A1、SP -A2 及IL -8表達水平變化。

3.siRNA 轉染HK-2 細胞:轉染所用SP -A1 及SP -A2特異性siRNA 購自德國QIAGEN 公司(SP -A1，SI04353202;SP-A2，SI00716590)。按照3 ×105個/孔的密度將細胞種植于6 孔板內，然后將含有150ng 的siRNA 或者用作陰性對照的negative siRNA(Cat. No. SI02693285)分別與15μl HiPerfect轉染試劑的混合液加入培養基內，37℃培養箱內轉染24h 用于后續實驗。

4.實時定量PCR 檢測SP -A1、SP -A2 表達:Trizol 法提取細胞RNA，2μgRNA 行反轉錄，產物即為cDNA。采用25μl反應體系行PCR 擴增，PCR 反應條件:(1)SP-A1:SP-A1 引物上游:5' - AAGCAGCTGGAGGCTCTGT - 3'，下游:5' -TGCTCTCACTGACTCACACCA-3'，退火溫度59.3℃。(2)SP-A2:SP-A2 引物上游:5' -GAGCCTGAAAAGAAGGAGCA-3'，下游:5' - TCCAACACAAACGTCCTTCA - 3'，退火溫度57℃。(3)β - actin:β - actin 引物上游:5' - GTCCACCGCAAATGCTTCTA -3'，下游:5' - TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。

5.ELISA 法檢測IL-8 蛋白表達:取細胞上清液，離心去細胞碎片，按ELISA 試劑盒說明書操作，分別檢測各組中IL-8 蛋白濃度。

6.統計學方法:采用SPSS 13.0 軟件進行統計學分析，各數值用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗，P ＜0.05 差異有統計學意義。

結 果

1.LPS 刺激對HK -2 細胞SP -A1、SP -A2 表達的影響:實時定量PCR 示，1μg/ml LPS 作用HK -2 細胞8h 可顯著增加其SP -A1、SP -A2 mRNA 的表達(P ＜0.05)。

圖1 LPS 對HK-2 細胞SP-A1、SP-A2 表達的影響

2.轉染siRNA 后各組HK-2 細胞SP-A1、SPA2 mRNA 表達:實時定量PCR 示，HK -2 細胞轉染SP-A1 siRNA 后，SP-A1 mRNA 表達水平較未轉染組及轉染陰性對照siRNA 組顯著降低(P ＜0.05)，SP-A2 mRNA 表達水平未見明顯變化。轉染SP -A2 siRNA 后，SP -A2 表達水平較未轉染組及轉染陰性對照組顯著降低(P ＜0.05)，SP -A1 mRNA 表達水平未見明顯變化，轉染陰性對照siRNA 不影響SP -A1、SP-A2 mRNA 表達水平(P ＞0.05，圖2)。

圖2 轉染不同siRNA 后HK-2 細胞SP-A1、SP-A2 mRNA 表達

3.HK-2 細胞轉染不同siRNA 后對LPS 誘導的IL-8 表達的影響:ELISA 示，1μg/ml LPS 作用8h 可顯著增加HK-2 細胞IL -8 的分泌(P ＜0.05)。轉染陰性對照siRNA 及SP -A1 siRNA 對LPS 誘導的IL-8 的表達未見明顯改變(與單純LPS 刺激組相比，P 均＞0.05)，而轉染SP -A2 siRNA 則可顯著抑制LPS 誘導的IL-8 的表達(P ＜0.05，圖3)。

圖3 轉染不同siRNA 后對LPS 誘導HK-2 細胞IL-8 表達的影響

討 論

SP-A 是選擇素蛋白家族的成員之一，最早在肺泡Ⅱ型上皮細胞中發現，可降低肺泡表面張力，對于維持肺泡擴張狀態有重要作用。同時，SP-A 在天然免疫中也發揮著重要作用，其在炎癥狀態下可促進NF-κB 的活化，進而促進多種炎性因子的產生［4］。本研究組先前的研究表明，SP-A 在腎臟內主要分布于腎小管上皮細胞，其在動物及人類的泌尿系感染時表達均增加，且SP-A 的基因多態性與泌尿系感染的易感性有關［5，6］。進一步的研究發現，SP -A/D 雙基因敲除小鼠對泌尿系感染的易感性增加，其在發生泌尿系感染時IL -8 分泌較野生型小鼠減少［3］。但其具體作用機制及SP-A 亞型在其中的作用目前尚不明確。SP-A 有兩個亞型，SP -A1 及SP -A2，關于SP-A 亞型在腎臟炎癥中所起的作用，目前研究的較少，值得進一步研究。

既往的研究表明，SP -A1 及SP -A2 在功能上有所不同，其主要區別在于調節炎性因子分泌及增強巨噬細胞吞噬中作用的差異，既往研究發現SP -A2在調節單核細胞IL -8 及TNF -α 分泌中的作用較SP-A1 強［7］。但目前尚無分別特異性針對SP -A1及SP-A2 的抗體，其針對SP-A1 及SP-A2 的mRNA 表達水平變化就顯得尤為重要［7］。LPS 可激活腎小管上皮細胞NF-κB，進而誘導IL -8 等多種炎性細胞因子產生。IL -8 是參與機體炎癥與免疫的重要細胞因子，與腎臟感染的關系密切，其在泌尿系感染起募集中性粒細胞浸潤的作用。本研究發現，LPS可誘導SP -A1、SP -A2 及IL -8 表達上調，這與既往筆者的研究結果相符［2］。本研究中進一步發現，采用特異性siRNA 下調SP -A2 表達可抑制LPS 誘導的腎小管上皮細胞IL -8 的上調，而改變SP -A1表達則未見對LPS 誘導的IL-8 表達有所影響，說明在SP-A 亞型中的SP -A2 可能在LPS 誘導腎小管上皮細胞的炎性因子表達中發揮重要作用，這可能是SP-A/D 雙基因敲除小鼠在泌尿系感染時IL -8 分泌不足的機制之一，因LPS 是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分之一，而SP -A/D 雙基因敲除小鼠缺乏了SP-A2 在LPS 誘導IL -8 中的促進調節作用，因此其在感染時IL-8 分泌不足，從而對泌尿系感染的易感性增加。

綜上所述，LPS 可誘導HK -2 細胞SP - A1 及SP-A2 表達增加，下調SP -A2 可部分抑制LPS 誘導的腎小管上皮細胞IL -8 的表達，SP -A2 在腎臟炎性反應中發揮重要作用。

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2 Jiao L，Fengqi H，Guirong W，et al. Lipopolysaccharide-induced expression of surfactant proteins A1 and A2 in human renal tubular epithelial cells［J］. J Inflamm (Lond)，2013，10(1):2

3 胡鳳琪，袁海，王桂榮，等. 表面活性蛋白A 及D 在小鼠尿路感染中的作用及機制［J］.中華腎臟病雜志，2013，29(6):439 -443

4 Gardai SJ，Xiao YQ，Dickinson M，et al. By binding SIRPα or calreticulin/CD91，lung collectins act as dual function surveillance molecules to suppress or enhance inflammation［J］. Cell，2003，115(1):13 -23

5 胡鳳琪，丁國華，梁偉，等.全反式維甲酸對腎盂腎炎大鼠表面活性蛋白-A 表達的影響［J］.武漢大學學報:醫學版，2010，31(1):51-53

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7 Floros J，Wang G，Mikerov AN. Genetic complexity of the human innate host defense molecules，surfactant protein A1 (SP -A1)and SP-A2 - -impact on function［J］. Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2009，19(2):125 -137