Exendin-4 對游離脂肪酸誘導肝細胞sirt6 表達及其對糖異生作用的影響

肖元元 王倩倩 毛月芹 魏美林 韓峻峰 殷 峻 魏 麗

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種由多病因引起的肝細胞內脂質蓄積過多所導致的臨床綜合征，它除了可以引起相關肝臟疾病如肝硬化、肝癌等疾病的發生以外，還與肥胖、血脂紊亂、2 型糖尿病、高血壓等代謝綜合征密切相關［1］。肝內過量的游離脂肪酸(FFA)及其異常代謝產物的過度堆積是造成肝細胞過度脂性凋亡，進而導致NAFLD 的主要原因［2］。Exendin-4 是胰高血糖素樣肽1(GLP -1)受體激動劑，是一類目前廣泛用于糖尿病治療的新型藥物，因其降糖效果顯著，可明顯降低體重，并且低血糖發生率較低而在糖尿病及肥胖癥的臨床治療中得到應用［3］。除了對糖尿病有顯著治療效果以外，近年來的許多研究發現GLP -1 可以同樣顯著調節肝臟糖脂代謝。sirt6 是酵母染色質沉默因子(silent information regulator 2，sir2)同系物家族中的一員，近年來因其在基因的維護和修復、細胞存活和凋亡、炎癥、心血管功能、氧化應激、壽命以及代謝和能量合成等方面所發揮的重要作用而受到越來越多的關注。研究發現sirt6 可以參與肝臟糖異生、糖酵解以及脂肪酸合成等關鍵步驟的調節［4］。關于肝臟脂質沉積是否會對sirt6 表達產生影響以及Exendin-4 是否可以通過sirt6 調節肝臟的糖脂代謝及其相關機制目前還不是很清楚。鑒于此，本課題旨在通過游離脂肪酸誘導肝細胞發生脂肪性病變模型，觀察Exendin -4 對sirt6表達的影響以及其在肝臟糖異生作用中的調控機制。

材料與方法

1.材料:人肝癌HepG2 細胞株由上海市糖尿病研究所保存。棕櫚酸、油酸、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma 公司。sirt6 Stealth RNAi 干擾質粒、對照干擾質粒、Lipo -fectamine2000 購自Invitrogen 公司。DMEM 培養液、胎牛血清購自Gibco 公司。兔抗sirt6 單克隆抗體購自Abcam 公司。兔抗β-actin 抗體購自CST 公司。辣根過氧化物酶標記的抗兔、抗小鼠二抗購自美國Promega 公司。ECL 化學發光反應試劑購自美國Millipore 公司。cDNA 反轉錄合成試劑盒購自TaKaRa 公司。MTT 試劑、BCA 蛋白測定試劑盒購自碧云天公司。

1.方法:(1)細胞培養:HepG2 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養液中，每2 天傳代1 次。在37℃、95%濕度和5%CO2條件下進行常規培養。取對數生長期細胞接種于細胞培養板，待細胞生長至70% ～80%后，給予相應處理。對照組給予含1% BSA 的DMEM 培養，對照組分別給予300μmol/L 濃度的游離脂肪酸(棕櫚酸與油酸比例為2∶1)與1%BSA 對待24h 后，再給予100nmol/L 濃度Exendin-4 對待24h。(2)油紅O 染色:油紅O 染料經異丙醇溶解后過濾，置于4℃備用。HepG2 細胞經過不同處理后棄培養液，PBS 洗3次，經10%多聚甲醛固定液固定后，加油紅O 染液于細胞表面10min。用60%異丙醇洗細胞2 次，以去除多余的染料，自來水清洗，倒置顯微鏡下觀察，拍照。(3)siRNA 干擾實驗:將HepG2 細胞接種于6 孔板，在無抗生素的含10%胎牛血清的DMEM 培養基中培養24h，使其在轉染時的轉染密度約30% ～50%。將sirt6 stealth RNAi 和Stealth siRNA negative control 用Lipofectamine 2000 根據說明書轉染HepG2 細胞。轉染后48h，采用Western blot 法和RT -PCR 法檢測Stealth RNAi 對sirt6 基因的沉默程度。(4)細胞RNA 的提取與RT -PCR:將接種于6 孔板內的HepG2 細胞按Trizol 說明書步驟提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 濃度，用RT-PCR 法擴增檢測目的基因。目的基因引物設計見表1。反轉錄反應體系20μl，42℃溫育50min，95℃加熱5min，冰上放置終止反應。PCR 擴增采用20μl 反應體系。95℃預變性5min，95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸40s，經30 個循環，72℃延伸10min。PCR 產物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后在紫外燈下照相。比較目的基因與內參基因β -actin 相對比值，計算表達水平。(5)Western blot 法實驗:收集各組細胞，預冷PBS 洗細胞2 次。加入細胞裂解液，冰上裂解30min，4℃12000r/min 離心15min。取上清，此為細胞總蛋白，用BCA 法蛋白定量。將已定量好的細胞總蛋白與6 ×蛋白電泳上樣緩沖液按5∶1比例混合。95℃水浴變性5min，冰上冷卻備用。20～30μg 的蛋白經SDS -PAGE 電泳，再轉移至硝酸纖維素膜上。轉膜后用5%脫脂牛奶/TBST 封閉90min，分別用兔抗人sirt6、β-actin 等抗體，4℃孵育過夜。TBST 洗10min ×3 次。分別加HRP 標記的抗兔二抗室溫孵育2h(1∶5000)。TBST 洗10min×3 次。用ECL 試劑進行顯影曝光，掃描圖像分析。

3.統計學方法:采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析，數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

表1 PCR 引物序列

結 果

1.游離脂肪酸誘導HepG2 細胞的脂肪酸沉積:分別用0 和300μmol/L 的游離脂肪酸對待HepG2 細胞24h 后，與對照組相比，300μmol/L 游離脂肪酸對待組細胞后，細胞內油紅O 染色加深，脂質沉積現象明顯增加，提示肝細胞發生脂肪性病變(圖1)。

圖1 油紅O 染色評估游離脂肪酸誘導HepG2 細胞的脂肪性病變(×200)

2. Exendin-4 逆轉由游離脂肪酸所導致的HepG2 細胞內sirt6 表達的下調:研究發現，棕櫚酸可以顯著降低HepG2 細胞內sirt6 的表達水平。與對照組相比，游離脂肪酸處理組中sirt6 表達水平約下降了50%，而當使用100nmol/L 的Exendin-4 處理24h后，則可以明顯的逆轉由游離脂肪酸所導致的sirt6表達的下調(圖2)。這些結果提示Exendin -4 可能會影響肝細胞內sirt6 的表達。

圖2 各組細胞中sirt6 蛋白表達水平變化

3.Exendin-4 可以通過激活sirt6 下調肝細胞內糖異生基因的表達:過去的研究發現GLP -1 可以通過影響肝臟的糖異生水平起降低血糖的作用。體內和體外的實驗均證實GLP -1 可以通過抑制肝臟糖異生關鍵基因G6Pase 和PEPCK 的表達進而影響肝臟的糖異生。筆者的研究發現，Exendin-4 可以顯著降低HepG2 內由游離脂肪酸對待所導致的G6Pase和PEPCK 兩個糖異生關鍵基因mRNA 水平的升高。然而當使用基因干擾抑制sirt6 基因的表達后，sirt6在蛋白與基因水平的表達均被顯著下調(圖3)，而且Exendin-4 對糖異生的改善作用則消失不見(圖4)。因此筆者認為sirt6 參與了Exendin-4 對肝臟糖異生作用的調節。

圖3 sirt6 表達抑制后各組細胞sirt6 蛋白表達情況

圖4 sirt6 表達抑制后各組細胞sirt6 及糖異生相關基因的表達情況

討 論

非酒精性脂肪肝是由多種原因所導致的體內游離脂肪酸的增高，進而引起的肝臟脂質的過度堆積所引起的疾病［5］。隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病的發生率呈現逐年上升的趨勢。非酒精性脂肪肝患者主要表現為肝臟的胰島素抵抗，而肝臟的胰島素抵抗則是造成空腹及餐后血糖升高的主要原因之一。因此，非酒精性脂肪肝的發生、發展，與糖尿病及肥胖等代謝性疾病的發生、發展息息相關。棕櫚酸和油酸是日常飲食中常見的長鏈脂肪酸。既往已有研究通過使用棕櫚酸與油酸的混合物成功誘導了肝細胞的脂肪性病變［6］。在筆者的試驗中，同樣使用這種方法對細胞給予不同濃度和時間的游離脂肪酸對待后，通過對細胞活力以及凋亡的檢測筆者選擇對細胞毒性最低的藥物劑量和作用時間，在進行細胞的油紅O 染色后，筆者成功構建了HepG2 細胞的脂肪性病變模型。

Exendin-4 是一種胰高血糖素樣肽-1 類似物，發揮GLP-1 受體激動劑的功能。因其具有葡萄糖刺激的促進胰島素分泌、延緩胃排空以及抑制食欲等作用，是目前臨床上較為有效的治療2 型糖尿病的新型藥物［7］。除了胰腺組織，最近的研究發現在肝臟組織同樣存在GLP -1 受體的表達，并且GLP -1 對肝臟的糖脂代謝也有重要的調節作用［8］。GLP-1 可以有效地減少肝臟的脂質含量，降低體內膽固醇、甘油三酯以及轉氨酶水平［9，10］。此外由于肝臟在維持體內血糖平衡中的重要作用，研究GLP -1 對肝臟肝糖分解以及糖原合成的影響也受到越來越多的關注。Fan 等［11］的研究發現，Exendin-4 治療3 個月的小鼠肝臟中糖異生關鍵激酶G6Pase 和PEPCK 的表達水平顯著下降。同時Lee 等［12］的研究也發現，對肥胖小鼠體內給予過表達GLP -1，通過下調糖異生關鍵激酶的表達，顯著地降低了肝糖輸出。

在筆者的實驗中同樣發現，在給予游離脂肪酸對待的肝細胞中，油紅O 染色發現肝細胞發生明顯的脂肪性病變，模仿了體內非酒精性脂肪肝的患病狀態。同時檢測肝細胞內糖異生關鍵基因G6Pase 和PEPCK 發現兩者的表達水平被顯著上調，但是在此基礎上筆者同時對細胞給予GLP -1 類似物Exendin-4 處理后，這種由非游離脂肪酸所導致的肝臟糖異生水平的升高可以被顯著逆轉，由此可以說明Exendin-4 對肝臟脂肪性病變誘導的體內糖異生水平的升高具有明顯的治療效果。

Sirtuins 是一種NAD+的去乙酰化酶家族，在調節包括細胞活力、發育、染色質動力、DNA 修復以及代謝等生理過程中發揮重要作用［13］。sirt6 是該家族中的一員，特別參與調節哺乳動物的衰老以及代謝等過程［14］。研究發現體內過表達sirt6 可以有效降低血清甘油三酯以及膽固醇水平，而肝臟特異性敲除sirt6 則可以增加肝臟糖酵解以及甘油三酯的合成，并降低脂肪酸的β 氧化促進脂肪肝的發生［15］。Dominy等［16］的研究發現，這種調節主要與sirt6 參與調節GCN5 的去乙酰化進而導致PGC -1α 的乙酰化有關，而PGC-1α 又是肝臟糖異生基因表達的關鍵調節轉錄因子。鑒于以上的研究結果，筆者假設Exendin-4 可以具有通過對肝臟sirt6 表達的調控進而降低肝臟糖異生的作用。

通過筆者的實驗發現，游離脂肪酸對待的肝細胞內sirt6 表達顯著降低，而Exedin-4 聯合處理后則可以相應改善這一現象。同時，筆者的實驗通過siRNA干擾技術下調肝細胞內sirt6 的表達水平后，不但Exendin-4 對sirt6 表達的調控作用消失，同時Exendin-4 也無法顯著抑制由高游離脂肪酸對待所導致的肝細胞內糖異生基因水平的升高。這些結果均說明在肝細胞內Exendin-4 可能是通過激活sirt6 進而影響肝臟的糖異生，起到減少肝糖輸出降低血糖的作用。這些將為以后更好地應用GLP -1 類似物藥物治療非酒精性脂肪肝、胰島素抵抗、2 型糖尿病以及相關代謝綜合征提供理論依據。

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