紫云英根瘤菌不同菌株間結瘤競爭能力的比較

2015-01-15 20:51:22鄭會明翟娜娜毛怡玲鐘增濤

江蘇農業科學 2014年11期

鄭會明+翟娜娜+毛怡玲+鐘增濤

摘要：通過競爭結瘤試驗研究紫云英根瘤菌不同菌株間的競爭結瘤能力，以紫云英寧波大橋品系為宿主植物，7株分離自不同生境紫云英根部瘤體內的菌株與中慢生華癸根瘤菌7653R為研究對象，采用單獨接種、與7653R菌株1∶1混合接種方式，在30d時采樣，統計根瘤數量、根瘤質量、不同菌株的占瘤率、定殖能力等。結果發現，紫云英根瘤菌2號菌株的競爭能力與7653R相當，其他菌株的競爭性都不同程度地弱于7653R，尤其是1號菌株的定殖能力最弱，僅是7653R占瘤率的9%。在同時含有2種根瘤菌的瘤體內，7653R和競爭菌株的數量比例相近。不同生境根瘤菌的競爭結瘤能力存在差異，試驗同時獲得了1株與經典菌株7653R競爭能力相當的紫云英根瘤菌菌株。

關鍵詞：紫云英根瘤菌；7653R；競爭性；占瘤率

中圖分類號：S182文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0403-03

豆科植物的固氮作用是在根瘤菌的參與下完成的，其過程包括根瘤菌吸附侵染豆科植物根毛，引起根毛卷曲形成侵入線，最終引起植物形成根瘤，根瘤菌在根瘤內部進行生物固氮并將其產物輸送給植物。該共生固氮體系在促進農業可持續發展、減少化學氮肥施用、保護生態環境等方面都具有極其重要的意義，因而研究、開發、利用這一共生固氮體系具有重大的生態、經濟和社會價值[1]。大豆、豌豆、苜蓿、三葉草、菜豆等豆科植物可以作為動物以及人類的食物氮源；紫云英可作為田間作物的氮肥提高作物產量，也可作為綠肥在貧瘠的土壤中生長，從而提升土壤質量。我國已在浙江、福建、江蘇等地廣泛種植紫云英、苜蓿、三葉草等豆科固氮植物，作為綠肥或者牲畜食料。

實踐證明，接種與不接種根瘤菌關系到綠肥植物收獲量的多少，但由于人工接種的根瘤菌劑與土著根瘤菌之間存在競爭性，往往不能達到預期的接種效果[2]，也阻礙了固氮菌株應有效用的發揮。近年來在競爭結瘤機制和根瘤菌寄主特異性方面的研究取得了許多進展，對根瘤菌競爭結瘤相關基因及豆科植物的寄主專一性結瘤相關基因均有了一定的認識。其中根瘤菌本身的基因型對競爭結瘤能力具有重要影響，目前已經報道了根瘤菌的運動性、趨化性、細菌素的產生[3]、生長繁殖速度、細胞表面特征、結瘤相關基因[4]，如大豆慢生根瘤菌中的nfeC基因[5]、中華苜蓿根瘤菌中的nifA基因等[6]，它們在結瘤競爭力方面發揮了重要的作用。

影響競爭結瘤的因素復雜多樣，解決方案也很多，但篩選使用競爭結瘤能力高的根瘤菌和選育抑制土著根瘤菌結瘤的植物品種是最佳的途徑。陳華癸等最先在我國分離獲得紫云英根部有效結瘤的菌株中慢生華癸根瘤菌[7]，目前在田間試驗中被廣泛接種應用的是具有良好結瘤固氮能力的7653R，該菌株同時還作為中慢生紫云英根瘤菌的典型菌株，其基因組已由華中農業大學初步完成測定。本研究從不同生境環境紫云英的根部瘤體中分離了9株紫云英根瘤菌，比較了其在不同品種紫云英根部結瘤的能力，同時還研究了其與典型菌株7653R共同接種時的競爭結瘤能力，初步獲得了1株與7653R結瘤能力相當的菌株，為后續大田的接種使用提供了材料，同時也為后續研究競爭結瘤能力相關的遺傳學分析提供了新的試驗對象。

1材料與方法

1.1供試菌株與材料

試驗所用菌株為中慢生華癸根瘤菌7653R，由華中農業大學饋贈。其他9株紫云英根瘤菌分離自不同生境紫云英根部瘤體內。根瘤菌培養所用培養基均為TY培養基[8]，所用抗生素濃度為利福平（Rif）20μg/mL、鏈霉素（Str）100μg/mL。

紫云英種子閩紫5號由福建省土壤肥料所提供，粵肥1號、信陽種、弋江種、寧波大橋和閩紫6號由浙江省農業科學院提供；蛭石購自南京農業大學芳華園藝中心。

1.2種子表面消毒與催芽

將紫云英種子放入無菌三角瓶中，無菌水清洗數次以洗去種子表面的塵土；75%乙醇處理5min，無菌水洗3次；5%NaClO處理3min，無菌水洗10次以洗凈種子表面殘留試劑；加入適量的無菌水浸泡3h使其充分吸水膨脹，隨后分裝至平板中，使種子單層均勻地鋪開；將種子于22℃黑暗中倒置催芽（在平板蓋底部灑些無菌水以保持濕潤的催芽環境），約24h后種子露白，即可種植。

1.3確定紫云英植株品系及菌株

分別以粵肥1號、信陽種、弋江種、寧波大橋、閩紫6號和閩紫5號共6個品系紫云英種子作為宿主植物，活化中慢生紫云英根瘤菌菌株至D600nm約為2.0，浸泡已發芽紫云英種子20min，種植入一次性杯子盛裝的無菌蛭石中，設置溫室溫度為白天16℃、12h，黑夜22℃、12h，適時適量澆灌無菌水和無氮營養液。每組種植6盆，每盆5株苗，待第1張真葉長出后，間苗，留下生長狀態趨于一致的20株苗；同時接種無菌水處理作為空白對照。分別在15、30d時觀察結瘤情況，以結瘤情況確定競爭結瘤試驗的供試菌株和紫云英種子品系。

1.4競爭結瘤試驗

TY培養基中活化根瘤菌細胞密度至D600nm約2.0，將7653RStr抗性突變株菌液與其他根瘤菌Rif抗性突變株培養菌液等體積（4mL∶4mL）混合，振蕩混勻，浸泡紫云英種子20min，種植，以單獨接種處理組作為對照；以接種無菌水處理作為空白對照。每組處理設置20株紫云英重復。

1.5根瘤數量、根瘤重量統計及菌體分離

小心拆盆，輕輕抖落根部蛭石，剪取每顆根瘤，記錄瘤數、瘤質量。將單個根瘤瘤體置于1.6%NaClO下處理1min進行表面消毒殺菌，水洗4次，去除殘留藥物。將表面消毒后的單個根瘤置于1.5mL離心管中，搗碎后用500μL無菌水懸浮，振蕩混勻后，取100μL該菌液到900μL無菌水中，依次進行梯度稀釋至10-4。對于單獨接種根瘤菌的紫云英植株，每個梯度各取10μL點樣于TY空白板，待長出單菌落后，計數；對于混合接種根瘤菌的紫云英植株根瘤，每個梯度各取10μL點樣于分別含有Str100μg/mL、Rif20μg/mL的TY平板上，待長出單菌落后，計數。endprint

2結果與分析

2.1確定紫云英植物品系及根瘤菌菌株種類

從不同生境紫云英根部瘤體分離到了9株根瘤菌，分別單獨接種至6個品系的紫云英種子，在15、30d時觀察結瘤情況，以7653R菌株作為陽性對照菌。如表1所示，從根瘤菌結瘤專一性看，8、9號菌株與紫云英共生結瘤的專一性很強，在15d時只與信陽種共生結瘤；而1～7號菌株對宿主的專一性較低。從紫云英植物宿主的專一性看，信陽種、弋江種和寧波大橋種對菌種的專一性較其他品系要低：15d時，信陽種可以與所有測試菌株共生結瘤；30d時，弋江種、寧波大橋種均能和所有菌株共生結瘤。

2.2紫云英根瘤菌分離菌株與其Rif抗性菌株結瘤能力的鑒定

在以上結瘤試驗基礎上，選用可以與所有測試菌株有效結瘤的寧波大橋種作為后續紫云英根瘤菌競爭結瘤試驗的宿主植物，1～7號菌株作為根瘤菌侵染對象。為了區分瘤體內紫云英根瘤菌的種類，需要選擇合適的篩選標簽，抗生素是被廣泛應用的標簽之一[9]。本研究篩選獲得了1～7號7株紫云英根瘤菌的Rif自發突變抗性株Z1-Z7，檢測了Rif抗性的產生是否會影響原有根瘤菌的結瘤能力。

分別將野生型菌株與Rif抗性株單獨接種到紫云英植株，結果如圖1所示，野生型和Rif抗性突變株根瘤數量、根瘤質量均無顯著差異，因此后續可以用Rif抗性突變株代表野生型菌株進行與7653R間的競爭結瘤試驗。

[FK（W20][TPDHM1.tif][FK）]

2.3紫云英分離菌株與7653R間的競爭結瘤

在實踐中接種根瘤菌劑到土壤中時，根瘤菌劑與土著菌的濃度未知、二者之間的數量比值也不確定。在本競爭結瘤試驗中，設置了2種接種液濃度，為了更接近于實際菌劑接種中的細胞密度，分別設置了1.0×106CFU/mL和1.0×107CFU/mL2種接種液濃度，浸泡已輕微發芽的紫云英種子，各20個重復。

在接種后30d時，統計各處理的根瘤菌總數和結瘤數量。結果發現，在結瘤數量上，1、2、5、7號菌株與7653R混合接種處理后，根瘤數量比單獨接種處理組時稍少（圖2），3號菌株與7653R混合接種后結瘤數量比單獨接種時稍多。在瘤體質量上，僅4號菌株混合接種的瘤體質量低于單獨接種菌株。這說明菌種之間的競爭可能會影響植株的結瘤情況，但影響都不顯著。

在2種不同根瘤菌共同接種過程中，競爭性結瘤主要是通過比較瘤體內根瘤菌的數量比率，即占瘤率來衡量的[10]。將7653R和1～7號菌株分別1∶1混合接種至紫云英根部，30d后，統計每處理中根瘤菌的占瘤率情況。如圖3所示，在所有類型的混合接種處理中，86.96%～94.29%的瘤體都是單個根瘤菌侵染形成，而2種不同根瘤菌共同侵占同一瘤體的比率只有5.71%～13.04%，該結果與Gage等的研究結果

一致[11]。在所有的共同接種試驗中，多數菌株（1、3、4、5、6、7號菌株）的競爭性都不同程度地弱于7653R，占瘤率僅是7653R的43%～62%，尤其是1號菌株的定殖能力最弱，約是7653R占瘤率的9%。該結果顯示出了傳統大田應用菌株7653R良好的競爭能力，但同時也表明，2號菌株在瘤體中的占瘤率為48.77%，與7653R的競爭能力相當（42.44%），這顯示了不同紫云英根瘤菌競爭能力的差異。

根瘤菌競爭能力的比例還可以通過考察2種根瘤菌共同占據的瘤體內根瘤菌的數量比例。將圖3中2種根瘤菌共同占據的瘤體搗碎后，進行梯度稀釋計數，據抗性計算其中2種不同根瘤菌確切的細菌數量，計算數量比值。如圖4所示，在7653R與紫云英分離菌株共同占據的瘤體內，7653R與不同根瘤菌的數量比均接近1，其數量相當。

3討論

將紫云英根瘤菌經典菌株7653R與分離自不同生境的9株紫云英根瘤菌菌株，分別單獨接種于閩紫1號、閩紫6號、粵肥2號、弋江種、信陽種、閩紫5號、寧波大橋共6個品系的紫云英植株，確定結瘤專一性較低的7株紫云英根瘤菌和寧波大橋種子作為后續競爭試驗的研究菌株。

在7653R和1～7號菌株間進行競爭結瘤，結果發現單接處理組之間、混接處理組之間在根瘤數量、根瘤質量、結瘤時間方面均無顯著差異。在統計了不同根瘤菌的占瘤率后，確定了2號菌株競爭性較強，與7653R占瘤率相當，其他檢測菌株則都低于7653R，尤其是1號菌株，其占瘤率僅是同時接種的7653R占瘤率的9%。在同時含有2種根瘤菌的根瘤內，7653R和混合接種的紫云英根瘤菌菌數比值多在0.1～10，且多集中在1附近，說明二者在同一根瘤內部的定殖能力相近。

根瘤菌與植物的共生固氮是二者之間不斷發生信號交流互作的過程，該過程還包括不同根瘤菌之間的競爭，人工接種的根瘤菌菌劑要取得良好的施肥效果，首先需要具有一定的與土壤中原有根瘤菌競爭的能力。已有的研究結果表明，影響根瘤菌競爭結瘤的因素主要是根瘤菌與宿主植物的遺傳因素，也和土壤的生態環境相關。將同一種根瘤菌接種到不同基因型的植株結瘤，其結瘤能力表現不同，即根瘤菌對宿主植物基因型有一定的依賴性，如有研究表明大豆的隱性基因rjl能抑制許多大豆慢生根瘤菌的結瘤[12]。根瘤菌本身基因型對競爭結瘤能力也有重要影響，一些根瘤菌產生的細菌素可抑制其他對該細菌素敏感的根瘤菌，如可以產生三葉草素的豌豆根瘤菌三葉草型T24菌株，可抑制對三葉草素敏感的菌株的結瘤，但三葉草素抗性菌株的結瘤則不受其抑制。田間試驗也證實，產生三葉草素的工程菌株比不產三葉草素菌株在占瘤率方面至少高20%，且在產量方面，也不遜于接種不產三葉草素的作物[3]。

本試驗結果對菌劑接種有一定的理論指導意義。將競爭能力與7653R相當的2號菌株制成菌劑可以接種到紫云英根部，最大限度地排斥土著根瘤菌，增強接種效果，以充分發揮生物固氮的作用，減少化肥的施用。在后續研究中，還可以將根瘤菌接種于不同品系的紫云英，考察不同的根瘤菌與何種品系紫云英植株共生結瘤能力最強，從而有針對性地進行根瘤菌菌劑的定向接種，提高接種效率，用最低的成本改善土壤環境或得到更多的鮮草量。endprint

參考文獻：

[1]LongSR.GenesandsignalsintheRhizobium-legumesymbiosis[J].PlantPhysiology，2001，125（1）：69-72.

[2]TriplettE.ThemoleculargeneticsofnodulationcompetitivenessinRhizobiumandBradyrhizobium[J].MolecularPlant-MicrobeInteraction，1990，3：199-206.

[3]RobletoEA，KmiecikK，OplingerES，etal.TrifolitoxinproductionincreasesnodulationcompetitivenessofRhizobiumetliCE3underagriculturalconditions[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1998，64（7）：2630-2633.

[4]TriplettEW，SadowskyMJ.Geneticsofcompetitionfornodulationoflegumes[J].AnnualReviewofMicrobiology，1992，46（1）：399-428.

[5]ChunJY，StaceyG.ABradyrhizobiumjaponicumgeneessentialfornodulationcompetitivenessisdifferentiallyregulatedfromtwopromo-ters[J].MolecularPlant-microbeInteractions，1994，7（2）：248-255.

[6]SanjuanJ，OlivaresJ.NifA-NtrAregulatorysystemactivatestranscriptionofnfe，agenelocusinvolvedinnodulationcompetitivenessofRhizobiummeliloti[J].ArchivesofMicrobiology，1991，155（6）：543-548.

[7]ChenH，ShuM.Noteontheroot-nodulebacteriaofAstragalussinicusL.[J].SoilScience，1944，58（4）：291-294.

[8]BeringerJE.RfactortransferinRhizobiumleguminosarum[J].JournalofGeneralMicrobiology，1974，84（1）：188-198.

[9]TasE，LeinonenP，SaanoA，etal.AssessmentofcompetitivenessofrhizobiainfectingGalegaorientalisonthebasisofplantyield，nodulation，andstrainidentificationbyantibioticresistanceandPCR[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1996，62（2）：529-535.

[10]GeorgeML，RobertFM.CompetitionamongRhizobiumleguminosarumbv.phaseolistrainsfornodulationofcommonbean[J].CanadianJournalofMicrobiology，1992，38（2）：157-160.

[11]GageDJ.AnalysisofinfectionthreaddevelopmentusingGfp-andDsRed-expressingSinorhizobiummeliloti[J].JournalofBacteriology，2002，184（24）：7042-7046.

[12]JosephsonKL，BourqueDP，BlissFA，etal.CompetitivenessofKIM5andViking1beanrhizobia：Strainbycultivarinteractions[J].SoilBiologyandBiochemistry，1991，23（3）：249-253.endprint