紅豆杉內生真菌產紫杉醇的培養基優化

趙赟鑫+張歡+鄧百萬+謝海彬

摘要：以紅豆杉內生真菌發酵的紫杉醇產量為指標，利用HPLC法進行檢測，篩選確定了發酵產紫杉醇的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是硝酸銨。在單因素試驗的基礎上，進一步采用L9（33）正交試驗優化培養基，培養基最佳組合為A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、硝酸銨6.0g/L、無水硫酸鎂0.3g/L，從而獲得最佳發酵培養基組成：葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、KH2PO40.5g/L、無水MgSO40.3g/L、維生素B10.05g/L，其紫杉醇平均含量達到938.6μg/L。

關鍵詞：紅豆杉；紫杉醇；內生真菌；培養基；優化

中圖分類號：Q939.9文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0389-04

紅豆杉通常為紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（TaxusL.）植物的總稱，全世界有11種，分布于北半球的溫帶至熱帶地區[1]。中國有4種1變種，即紅豆杉（T.chinensisRehd.）、東北紅豆杉（T.cuspidataSieb.etZucc.）、西藏紅豆杉（T.wallichianaZucc.）、云南紅豆杉（T.yunnanensisChangetL.K.Fu）、南方紅豆杉（T.chinensisvar.maireiChangetL.K.Fu）[2]。

自從美國化學家Wani等首次從太平洋紫杉（短葉紅豆杉T.brevifoliaNutt.）中分離出紫杉醇（taxol）并于1971年將其化學結構發表[3]，Schiff等證實紫杉醇具有獨特的抗癌機制[4]，20世紀80年代美國和歐洲的科學家相繼揭示出紫杉醇的抗癌療效[5]。1993年，美國蒙大拿州大學植物病理系的Stierle博士等從短葉紅豆杉（T.brevifoliaNutt.）的韌皮部中分離得到1種能夠產生紫杉醇的內生真菌安德魯紫杉菌（Taxomycesandreanae）[6]。

近些年來，紅豆杉產紫杉醇的研究進展很快，國內外學者利用內生真菌產紫杉醇的研究報道逐漸增多，其關鍵問題在于紫杉醇產生菌的分離和發酵液中紫杉醇產量的提高，要通過內生真菌發酵產紫杉醇達到工業化生產至少是毫克級，但目前采用該方法的普遍產量只有幾百微克，主要是因為缺乏高產、穩定的適于發酵的工業菌株，以及發酵條件的不合理而限制了單位發酵液中紫杉醇的含量。

培養基是人工配制的提供微生物生長、代謝、繁殖和合成人們所需目的產物的營養物質原料，同時，培養基也為微生物提供了營養物質以外的其他生長所必需的環境條件。培養基的組成和配比是否恰當對微生物的生長、產物的形成、產品的產量和質量都有很大的影響。筆者采用課題組自行分離的紫杉醇高產菌株MetarhiziumanisopliaeLB-10[7]，對其培養基組成和配比進行研究，優化碳源、氮源、微量元素的組成、濃度及其配比，以為工業化生產提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

內生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10，為分離自陜西省留壩縣野生紅豆杉的高產紫杉醇內生真菌。

1.1.2培養基

斜面培養基：PDA培養基；種子培養基：PDB培養基，馬鈴薯200g，葡萄糖20.0g，水1.0L，pH值6.0～8.0；初始發酵液：葡萄糖80.0g/L，NH4NO38.0g/L，無水KH2PO40.5g/L，無水MgSO40.5g/L，維生素B10.05g/L；無碳配方發酵液：NH4NO38.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，ZnSO41.0mg/L，維生素B10.05g/L；無氮配方發酵液：葡萄糖80.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，ZnSO41.0mg/L，維生素B10.05g/L；優化后發酵液：葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。

1.1.3藥品與試劑

紫杉醇標準品（≥98%），乙酸乙酯，甲醇，葡萄糖，蔗糖，淀粉，麥芽糖，NH4NO3，（NH4）2SO4，蛋白胨，酒石酸銨，KH2PO4，MgSO4·7H2O。

1.1.4主要儀器

高效液相色譜儀（LC2000），旋轉蒸發儀（RV-10，IKA），電子天平（TB-214），雙層恒溫干燥培養振蕩器（ZHWY-2102C），人工氣候箱（LRH-250-G-S），數控超聲波清洗儀（KQ-5200-DE）。

1.2方法

1.2.1培養方法

種子液培養方法：在新鮮斜面上取5mm×5mm大小的已純化的菌塊，接種到裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，于25℃、180r/min搖床上培養3d。

發酵培養：將培養好的種子液混勻，按3%接種量接種到裝有330mL發酵培養基的500mL三角瓶中，每次提取所用發酵液的量為1000mL，于28℃、180r/min搖床上培養10d。

1.2.2紫杉醇樣品的提取

通過對培養10d的發酵液進行抽濾，使其分離為菌液和菌絲體兩部分，菌絲用乙酸乙酯在超聲條件下萃取，菌液用乙酸乙酯通過分液漏斗萃取，分別重復3次，合并收集到的乙酸乙酯相，并用雙層濾紙過濾，濾液在40℃旋轉蒸發至干，樣品用甲醇溶解并定容至10.0mL，檢測。

1.2.3紫杉醇的HPLC檢測

紫杉醇標準品用甲醇定容至10.0mL，配置成0.01～0.16mg/mL的濃度梯度，繪制標準曲線。精確稱取紫杉醇標準品4.0mg，甲醇定容至10.0mL，從而得到母液濃度為0.4mg/mL，將母液依次稀釋成濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16mg/mL，取20.0μL進樣（n=5），得到回歸方程為y=6.0878+3589.3913x，r=0.9992。建立標準曲線，如圖1所示，采用外標法測定內生真菌發酵產物的乙酸乙酯抽提物中紫杉醇含量。endprint

色譜條件：水-甲醇-乙腈（33∶35∶32）為流動相，檢測波長為228nm，流速為1.0mL/min，進樣量為20.0μL，柱溫為室溫，色譜柱為C18（4.6mm×150mm）。

紫杉醇含量計算公式：

發酵液中紫杉醇的含量（μg/L）=[甲醇中紫杉醇的含量（mg/mL）×溶解提取物所用甲醇的體積（mL）×106]/提取時所取發酵液的體積（mL）。

每次提取的紫杉醇均做3個平行樣，分別經HPLC測定并通過公式計算發酵液中紫杉醇的含量，求其平均值。

1.2.4生物量的測定

取一定體積的發酵液4800r/min離心20min，菌絲體用蒸餾水洗滌2次，收集菌絲體，置于80℃烘箱中烘干至恒重，稱量，計算菌絲體生物量。

1.2.5培養基配方的優化方法

1.2.5.1單因素試驗

采取無碳配方發酵液培養，分別選取葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉為碳源，濃度均為80.0g/L，考察單因素碳源對LB-10紫杉醇積累和菌絲體生物量的影響，篩選出最適碳源進行初糖濃度的單因素試驗。

采取無氮配方發酵液培養，分別選取（NH4）2SO4、NH4NO3、酒石酸銨和蛋白胨為氮源，濃度均為8.0g/L，考察單因素氮源對LB-10紫杉醇積累和菌絲體生物量的影響，篩選出最適氮源進行初氮濃度的單因素試驗。

采取初始發酵液培養，選取無水MgSO4的不同濃度4.0、6.0、8.0、10.0、12.0g/L，研究無水MgSO4的不同濃度對LB-10菌體紫杉醇生物合成產量和菌絲體生物量的單因素影響。

1.2.5.2正交試驗及驗證性試驗

選取對菌體生長和紫杉醇積累有較大影響的最適碳源、最適氮源和硫酸鎂濃度，分別取3個水平，以紫杉醇產量為指標，進行L9（33）正交試驗以及驗證性試驗。

2結果與分析

2.1不同碳源的影響

生成次級代謝產物是由許多因素來調控的，比如碳源、氮源及微量元素[8]。碳源的主要作用是構成各種代謝產物的碳架和細胞物質，以及提供細胞活動所需的能量。

由圖2可知，生物量以蔗糖最高，葡萄糖次之，麥芽糖最低；在發酵培養過程中，以淀粉為碳源時，菌絲生長相對緩慢，老化快。紫杉醇產量以葡萄糖為碳源的最高，蔗糖次之，麥芽糖產紫杉醇量最低。

試驗結果表明，以蔗糖為碳源時對菌體生長比對紫杉醇積累更有利，以麥芽糖為碳源時對紫杉醇積累和菌體生長均不利，以葡糖糖為碳源時對紫杉醇積累比對菌體生長更有利，因此選擇葡萄糖為最適碳源。

2.2不同氮源的影響

氮源是生命有機體生長發育所必需的主要營養，主要是合成細胞結構和提供原生質的原料，一般所用的氮源可分為無機氮源和有機氮源2類。NH4NO3、（NH4）2SO4、酒石酸銨和蛋白胨等被國內學者研究時作為氮源使用[9]。

如圖3所示，以NH4NO3為氮源時菌體生物量和紫杉醇產量最高，蛋白胨次之，（NH4）2SO4為氮源時紫杉醇產量和菌體生物量均最低。

試驗結果表明，以蛋白胨、NH4NO3為氮源時對紫杉醇積累和菌體生長有促進作用，而采用（NH4）2SO4為氮源時對菌體的代謝有抑制作用，從而降低了紫杉醇的產量，因此選擇NH4NO3為最適氮源。

2.3不同初糖濃度的影響

糖類的濃度對紫杉醇的生物合成和內生真菌的生長具有很大影響。本試驗采用初始發酵培養基進行發酵，以葡萄糖為碳源，分別按照濃度50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100.0g/L的添加量進行發酵試驗，考察不同的碳源質量分數對LB-10產量的影響。

由圖4可知，LB-10產紫杉醇的含量首先隨著葡萄糖濃度升高而增加，當葡萄糖濃度達到60.0g/L時，紫杉醇產量以及菌體生物量達到最大。當碳源濃度為70.0g/L及以上時，

菌體生長受到了抑制，紫杉醇產量及菌體生物量都有所下降。結果表明，初糖濃度直接影響產物的積累和菌體的生長。當初糖濃度較高時，碳源更多地流向代謝產物的合成，隨著發酵時間持續，形成了大量非目的產物，抑制目的代謝產物的積累和菌絲體的生長，導致在初糖濃度較高的條件下，發酵液變得稠厚，使能量傳遞以及物質轉化變得困難，最終導致紫杉醇的產生受到抑制。因此最佳碳源濃度用量的選擇為60.0g/L。

2.4不同NH4NO3濃度的影響

提高培養基中氮源濃度對紅豆杉內生真菌的生長以及紫杉醇的生物合成也具有很大的影響。本試驗同樣采用了初始發酵培養基進行發酵，以NH4NO3為氮源，選取不同的氮源濃度4.0、6.0、8.0、10.0、12.0g/L進行試驗，不同氮源濃度對LB-10發酵產紫杉醇的影響結果如圖5所示。

由圖5可知，當氮源濃度為6.0g/L時，紫杉醇的生物合成量達到最大；當氮源濃度為12.0g/L時，在試驗范圍內菌絲體生物量達到了最大，而紫杉醇含量最低。結果表明，初始氮源濃度對紫杉醇積累和菌體生長有顯著影響。高濃度氮源對紅豆杉內生真菌的生長起到促進作用，但是抑制次級代謝產物的形成；隨著NH4NO3濃度升高，發酵液中的營養物質被用來合成大量的菌絲體，導致營養物質消耗過快，從而菌絲體過早地衰老，對后續合成及積累紫杉醇不利。因此為了兼顧紫杉醇含量和菌絲體生長，選擇6.0g/LNH4NO3為最佳氮源用量。

2.5不同MgSO4濃度的影響

由于在紫杉醇生物合成過程中，第一步限速反應是GGPP在紫杉二烯合成酶（taxadienesynthase）的催化下環化為紫杉烷三環二萜骨架，反應產物是taxa-4（5）、11（12）-diene，該酶是以Mg2+為唯一金屬催化劑的蛋白單體[10]，Mg2+的濃度對該酶的活性影響很大，進而影響紫杉醇的生物合成。endprint

由圖6可以看出，隨著無水MgSO4濃度升高，紫杉醇的生物合成量呈上升趨勢，在MgSO4濃度為0.5g/L時菌絲體生物量達到最高，紫杉醇的生物合成量也達到最大值；繼續提高濃度，菌絲體生物量和紫杉醇產量都開始下降。結果表明，Mg2+濃度對菌絲體生長和紫杉醇積累有一定的影響。Mg2+濃度過高，使紫杉二烯合成酶活性受到抑制，影響紫杉烷三環二萜骨架的合成，進而會降低紫杉醇產量。因此最佳MgSO4用量為濃度0.5g/L。

2.6培養基正交試驗

以上分析了培養基各組分及其濃度對發酵試驗的單因素影響，因為各個試驗批次之間往往差別較大，所以需要對各因素進行綜合考察，才能篩選出較優的工藝條件。正交試驗設計可通過多個因素的分析得到各因素在整體影響中的主次，同時能夠獲得各因素對試驗的影響規律，從而確定較優的工藝條件配比。

本試驗選取對紫杉醇積累和菌絲體生長有較大影響的葡萄糖、NH4NO3和MgSO4，分別取3個水平，以紫杉醇產量為指標，進行L9（33）正交試驗。試驗設計如表1所示，結果如表2和表3所示。

由表2可以看出，根據極差R值的大小，得到3個因素對試驗結果的影響次序為B>C>A，即NH4NO3濃度對產量影響最大，其次是MgSO4濃度，最后是葡萄糖濃度。

由表3方差分析結果可知，NH4NO3對紫杉醇產量的影響極顯著[F>F0.01（2，2）]，葡萄糖對紫杉醇產量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，MgSO4對紫杉醇產量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，因此選取的3個因素對紫杉醇產量影響均顯著。

以3個因素在不同水平下的均值對各水平作圖，如圖7所示，對于因素A和因素C，其均值水平變化呈現下降趨勢，因素B是先上升后下降，結果表明，最佳組合為A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、MgSO40.3g/L。

根據正交試驗結果篩選出最優發酵培養基組成為葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。

2.7驗證性試驗

采用優化后發酵液進行培養，即葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。以紫杉醇產量為指標，對LB-10菌株進行搖瓶發酵驗證性試驗，分別提取5次紫杉醇樣品進行HPLC檢測，結果如表4所示。結果表明，LB-10產紫杉醇產量的RSD為0.33%，說明測定方法的重現性較好，紫杉醇含量的平均值達到938.6μg/L，產量比常規方法提高了92.5μg/L。

3討論與結論

在筆者課題組自行篩選的高產紫杉醇內生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10的基礎上，篩選出最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為NH4NO3。通過單因素試驗分析，確定了葡萄糖、NH4NO3、無水MgSO4的最適濃度分別為60.0、6.0、0.5g/L。

進一步采取L9（34）正交試驗分析，獲得了三者在培養基中的最佳組合A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L，從而獲得了最佳發酵培養基的組成：葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L、KH2PO40.5g/L、維生素B10.05g/L，其紫杉醇平均含量達到了938.6μg/L。

研究發現，濃度適量的碳源和氮源都促進紫杉醇生物合成和菌體生長，但是當兩者濃度過高時，發酵液中的營養物質被用來合成大量菌絲體，導致營養消耗過快，大量非目的產物的形成會抑制目的代謝產物的積累和菌體生長，發酵液會變得稠厚，進而菌絲體過早衰老，對后續合成和積累紫杉醇均不利。因此，為了兼顧紫杉醇含量和菌體生長，需要選擇適宜的碳氮比。

參考文獻：

[1]侯寬昭.中國種子植物科屬詞典（修訂版）[M].北京：科學出版社，1982：481.

[2]中國科學院植物研究所編輯委員會.中國植物志：第七卷[M].北京：科學出版社，1978：438-443.

[3]WaniMC，TaylorHL，WallME，etal.Plantantitumoragents.Ⅵ.Theisolationandstructureoftaxol，anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，1971，93（9）：2325-2327.

[4]SchiffPB，FantJ，HorwitzSB.Promotionofmicrotubuleassemblyinvitrobytaxol[J].Nature，1979，277（5698）：665-667.

[5]梅興國，魯明波.紫杉醇的抗癌作用及治療其他疾病的潛力[J].國外醫學.藥學分冊，1996，23（3）：136-1367，138-140.

[6]StrobelGA，StierleA，StierleD，etal.Taxomycesandreanae，aproposednewtaxonforabulbilliferoushyphomyceteassotiatedwithPacificyew[J].Mycotaxon，1993，47：71-78.

[7]耿直，劉開輝，趙赟鑫，等.一株產紫杉醇中國紅豆杉內生真菌的分離和鑒定[J].微生物學通報，2010，37（2）：199-203.

[8]ParraR，AldredD，MaganN.MediumoptimizationfortheproductionofthesecondarymetabolitesqualestatinS1byaPhomasp.combiningorthogonaldesignandresponsesurfacemethodology[J].EnzymeandMicrobialTechnology，2005，37（7）：704-711.

[9]代文亮.產紫杉醇菌種的改良及若干種前體物質作用的研究[D].無錫：江南大學，2008.

[10]宣紅玉，劉家新，王健剛，等.紫杉醇生物合成途徑及調控研究進展[J].天然產物研究與開發，1998，10（3）：96-102.endprint

由圖6可以看出，隨著無水MgSO4濃度升高，紫杉醇的生物合成量呈上升趨勢，在MgSO4濃度為0.5g/L時菌絲體生物量達到最高，紫杉醇的生物合成量也達到最大值；繼續提高濃度，菌絲體生物量和紫杉醇產量都開始下降。結果表明，Mg2+濃度對菌絲體生長和紫杉醇積累有一定的影響。Mg2+濃度過高，使紫杉二烯合成酶活性受到抑制，影響紫杉烷三環二萜骨架的合成，進而會降低紫杉醇產量。因此最佳MgSO4用量為濃度0.5g/L。

2.6培養基正交試驗

以上分析了培養基各組分及其濃度對發酵試驗的單因素影響，因為各個試驗批次之間往往差別較大，所以需要對各因素進行綜合考察，才能篩選出較優的工藝條件。正交試驗設計可通過多個因素的分析得到各因素在整體影響中的主次，同時能夠獲得各因素對試驗的影響規律，從而確定較優的工藝條件配比。

本試驗選取對紫杉醇積累和菌絲體生長有較大影響的葡萄糖、NH4NO3和MgSO4，分別取3個水平，以紫杉醇產量為指標，進行L9（33）正交試驗。試驗設計如表1所示，結果如表2和表3所示。

由表2可以看出，根據極差R值的大小，得到3個因素對試驗結果的影響次序為B>C>A，即NH4NO3濃度對產量影響最大，其次是MgSO4濃度，最后是葡萄糖濃度。

由表3方差分析結果可知，NH4NO3對紫杉醇產量的影響極顯著[F>F0.01（2，2）]，葡萄糖對紫杉醇產量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，MgSO4對紫杉醇產量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，因此選取的3個因素對紫杉醇產量影響均顯著。

以3個因素在不同水平下的均值對各水平作圖，如圖7所示，對于因素A和因素C，其均值水平變化呈現下降趨勢，因素B是先上升后下降，結果表明，最佳組合為A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、MgSO40.3g/L。

根據正交試驗結果篩選出最優發酵培養基組成為葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。

2.7驗證性試驗

采用優化后發酵液進行培養，即葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。以紫杉醇產量為指標，對LB-10菌株進行搖瓶發酵驗證性試驗，分別提取5次紫杉醇樣品進行HPLC檢測，結果如表4所示。結果表明，LB-10產紫杉醇產量的RSD為0.33%，說明測定方法的重現性較好，紫杉醇含量的平均值達到938.6μg/L，產量比常規方法提高了92.5μg/L。

3討論與結論

在筆者課題組自行篩選的高產紫杉醇內生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10的基礎上，篩選出最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為NH4NO3。通過單因素試驗分析，確定了葡萄糖、NH4NO3、無水MgSO4的最適濃度分別為60.0、6.0、0.5g/L。

進一步采取L9（34）正交試驗分析，獲得了三者在培養基中的最佳組合A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L，從而獲得了最佳發酵培養基的組成：葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L、KH2PO40.5g/L、維生素B10.05g/L，其紫杉醇平均含量達到了938.6μg/L。

研究發現，濃度適量的碳源和氮源都促進紫杉醇生物合成和菌體生長，但是當兩者濃度過高時，發酵液中的營養物質被用來合成大量菌絲體，導致營養消耗過快，大量非目的產物的形成會抑制目的代謝產物的積累和菌體生長，發酵液會變得稠厚，進而菌絲體過早衰老，對后續合成和積累紫杉醇均不利。因此，為了兼顧紫杉醇含量和菌體生長，需要選擇適宜的碳氮比。

參考文獻：

[1]侯寬昭.中國種子植物科屬詞典（修訂版）[M].北京：科學出版社，1982：481.

[2]中國科學院植物研究所編輯委員會.中國植物志：第七卷[M].北京：科學出版社，1978：438-443.

[3]WaniMC，TaylorHL，WallME，etal.Plantantitumoragents.Ⅵ.Theisolationandstructureoftaxol，anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，1971，93（9）：2325-2327.

[4]SchiffPB，FantJ，HorwitzSB.Promotionofmicrotubuleassemblyinvitrobytaxol[J].Nature，1979，277（5698）：665-667.

[5]梅興國，魯明波.紫杉醇的抗癌作用及治療其他疾病的潛力[J].國外醫學.藥學分冊，1996，23（3）：136-1367，138-140.

[6]StrobelGA，StierleA，StierleD，etal.Taxomycesandreanae，aproposednewtaxonforabulbilliferoushyphomyceteassotiatedwithPacificyew[J].Mycotaxon，1993，47：71-78.

[7]耿直，劉開輝，趙赟鑫，等.一株產紫杉醇中國紅豆杉內生真菌的分離和鑒定[J].微生物學通報，2010，37（2）：199-203.

[8]ParraR，AldredD，MaganN.MediumoptimizationfortheproductionofthesecondarymetabolitesqualestatinS1byaPhomasp.combiningorthogonaldesignandresponsesurfacemethodology[J].EnzymeandMicrobialTechnology，2005，37（7）：704-711.

[9]代文亮.產紫杉醇菌種的改良及若干種前體物質作用的研究[D].無錫：江南大學，2008.

[10]宣紅玉，劉家新，王健剛，等.紫杉醇生物合成途徑及調控研究進展[J].天然產物研究與開發，1998，10（3）：96-102.endprint

由圖6可以看出，隨著無水MgSO4濃度升高，紫杉醇的生物合成量呈上升趨勢，在MgSO4濃度為0.5g/L時菌絲體生物量達到最高，紫杉醇的生物合成量也達到最大值；繼續提高濃度，菌絲體生物量和紫杉醇產量都開始下降。結果表明，Mg2+濃度對菌絲體生長和紫杉醇積累有一定的影響。Mg2+濃度過高，使紫杉二烯合成酶活性受到抑制，影響紫杉烷三環二萜骨架的合成，進而會降低紫杉醇產量。因此最佳MgSO4用量為濃度0.5g/L。

2.6培養基正交試驗

以上分析了培養基各組分及其濃度對發酵試驗的單因素影響，因為各個試驗批次之間往往差別較大，所以需要對各因素進行綜合考察，才能篩選出較優的工藝條件。正交試驗設計可通過多個因素的分析得到各因素在整體影響中的主次，同時能夠獲得各因素對試驗的影響規律，從而確定較優的工藝條件配比。

本試驗選取對紫杉醇積累和菌絲體生長有較大影響的葡萄糖、NH4NO3和MgSO4，分別取3個水平，以紫杉醇產量為指標，進行L9（33）正交試驗。試驗設計如表1所示，結果如表2和表3所示。

由表2可以看出，根據極差R值的大小，得到3個因素對試驗結果的影響次序為B>C>A，即NH4NO3濃度對產量影響最大，其次是MgSO4濃度，最后是葡萄糖濃度。

由表3方差分析結果可知，NH4NO3對紫杉醇產量的影響極顯著[F>F0.01（2，2）]，葡萄糖對紫杉醇產量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，MgSO4對紫杉醇產量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，因此選取的3個因素對紫杉醇產量影響均顯著。

以3個因素在不同水平下的均值對各水平作圖，如圖7所示，對于因素A和因素C，其均值水平變化呈現下降趨勢，因素B是先上升后下降，結果表明，最佳組合為A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、MgSO40.3g/L。

根據正交試驗結果篩選出最優發酵培養基組成為葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。

2.7驗證性試驗

采用優化后發酵液進行培養，即葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。以紫杉醇產量為指標，對LB-10菌株進行搖瓶發酵驗證性試驗，分別提取5次紫杉醇樣品進行HPLC檢測，結果如表4所示。結果表明，LB-10產紫杉醇產量的RSD為0.33%，說明測定方法的重現性較好，紫杉醇含量的平均值達到938.6μg/L，產量比常規方法提高了92.5μg/L。

3討論與結論

在筆者課題組自行篩選的高產紫杉醇內生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10的基礎上，篩選出最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為NH4NO3。通過單因素試驗分析，確定了葡萄糖、NH4NO3、無水MgSO4的最適濃度分別為60.0、6.0、0.5g/L。

進一步采取L9（34）正交試驗分析，獲得了三者在培養基中的最佳組合A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L，從而獲得了最佳發酵培養基的組成：葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L、KH2PO40.5g/L、維生素B10.05g/L，其紫杉醇平均含量達到了938.6μg/L。

研究發現，濃度適量的碳源和氮源都促進紫杉醇生物合成和菌體生長，但是當兩者濃度過高時，發酵液中的營養物質被用來合成大量菌絲體，導致營養消耗過快，大量非目的產物的形成會抑制目的代謝產物的積累和菌體生長，發酵液會變得稠厚，進而菌絲體過早衰老，對后續合成和積累紫杉醇均不利。因此，為了兼顧紫杉醇含量和菌體生長，需要選擇適宜的碳氮比。

參考文獻：

[1]侯寬昭.中國種子植物科屬詞典（修訂版）[M].北京：科學出版社，1982：481.

[2]中國科學院植物研究所編輯委員會.中國植物志：第七卷[M].北京：科學出版社，1978：438-443.

[3]WaniMC，TaylorHL，WallME，etal.Plantantitumoragents.Ⅵ.Theisolationandstructureoftaxol，anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，1971，93（9）：2325-2327.

[4]SchiffPB，FantJ，HorwitzSB.Promotionofmicrotubuleassemblyinvitrobytaxol[J].Nature，1979，277（5698）：665-667.

[5]梅興國，魯明波.紫杉醇的抗癌作用及治療其他疾病的潛力[J].國外醫學.藥學分冊，1996，23（3）：136-1367，138-140.

[6]StrobelGA，StierleA，StierleD，etal.Taxomycesandreanae，aproposednewtaxonforabulbilliferoushyphomyceteassotiatedwithPacificyew[J].Mycotaxon，1993，47：71-78.

[7]耿直，劉開輝，趙赟鑫，等.一株產紫杉醇中國紅豆杉內生真菌的分離和鑒定[J].微生物學通報，2010，37（2）：199-203.

[8]ParraR，AldredD，MaganN.MediumoptimizationfortheproductionofthesecondarymetabolitesqualestatinS1byaPhomasp.combiningorthogonaldesignandresponsesurfacemethodology[J].EnzymeandMicrobialTechnology，2005，37（7）：704-711.

[9]代文亮.產紫杉醇菌種的改良及若干種前體物質作用的研究[D].無錫：江南大學，2008.

[10]宣紅玉，劉家新，王健剛，等.紫杉醇生物合成途徑及調控研究進展[J].天然產物研究與開發，1998，10（3）：96-102.endprint