長白山道地藥材接骨木、苦碟子纖溶酶分離及活性檢測

夏廣清+劉偉+秦佳梅

摘要：從具有活血化瘀功能的長白山道地藥材接骨木、苦碟子中分離纖溶酶，并利用纖維平板法對分離的纖溶酶進行活性鑒定。結(jié)果表明：從接骨木和苦碟子中可以分離到具有溶栓活性的纖溶酶，其含量分別為1842μg/g及1976μg/g。尿激酶法測定其比活力分別為0.795U及0.837U，SDS-PAGE電泳檢測其大小約為36ku，該酶在高溫下失活，在70%～90%硫酸銨飽和溶液中活性最高。

關(guān)鍵詞：接骨木；苦碟子；纖溶酶；分離；活性檢測

中圖分類號：S567.01文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0315-02

心腦血管疾病是危害人類健康的主要疾病之一。近30年來，我國人群心血管疾病的發(fā)病率及危險因素水平呈不斷上升趨勢。據(jù)衛(wèi)生部心血管病防治中心發(fā)布的《中國心血管疾病調(diào)查報告2011》：目前，我國包括冠心病、腦中風(fēng)、心力衰竭和高血壓在內(nèi)的心血管病病人估計已達2.3億[1-2]。因此研發(fā)高效、特異、安全、副作用小的溶栓藥物，一直是近年來醫(yī)藥界的熱門課題[3]。隨著對中醫(yī)藥認識的發(fā)展，溶栓中草藥的研究也在不斷發(fā)展，已有部分中藥被制成了單味注射液，如刺五加、川芍、丹參、燈盞花、葛根素、紅花等[4]；同時，一些學(xué)者也在不斷研究新的溶栓藥用植物。接骨木、苦碟子作為長白山道地藥材，具有祛風(fēng)、活血，治風(fēng)濕筋骨疼痛，抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松及免疫活性等藥理作用[5-6]，但有關(guān)其在溶栓方面的研究尚未見相關(guān)報道。因此本研究以長白山道地藥材接骨木、苦碟子為試驗材料，采用硫酸銨沉淀，透析除去小分子物質(zhì)，用纖維平板法初步判斷接骨木、苦碟子粗提物中的溶纖成分，并對其活性做初步研究，為進一步開發(fā)具有溶栓功能的長白山道地藥材提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1中草藥接骨木、苦碟子采自通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實驗教學(xué)基地，經(jīng)生命科學(xué)學(xué)院秦佳梅教授鑒定。

1.1.2主要試劑纖維蛋白原、纖維蛋白溶酶原、凝血酶購自中國藥品生物制品檢定所，標準尿激酶、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶購自天津生物化學(xué)制藥廠。

1.2試驗方法

1.2.1接骨木、苦碟子蛋白質(zhì)的提取

稱取接骨木、苦碟子干粉2g，浸于200mLPBS緩沖液中，4℃保存過夜，間隔時間振蕩，離心（4℃，4000r/min）10min，取上清，加入80%飽和硫酸銨溶液，離心（4℃，8000r/min）10min，沉淀用PBS溶解，得到蛋白粗提液，裝入透析袋用PBS緩沖液透析，每隔2h換1次溶液，取透析后的蛋白溶液冷凍干燥，-80℃冰箱中保存，備用。

1.2.2樣品蛋白提取物濃度的測定

采用考馬斯亮藍（G-250）法[7]測定蛋白質(zhì)含量：取待測粗酶蛋白樣品溶液0.1mL，加入5.0mL考馬斯亮藍溶液，測定595nm處吸光度，計算供試樣品的蛋白濃度。

1.2.3蛋白提取物的體外纖溶活性鑒定

纖維平板的配制及尿激酶標準曲線制作參照夏廣清等的方法[8]。

1.2.3.1判斷纖溶成分是否為蛋白質(zhì)

將供試品在沸水浴中加熱10min，點纖維蛋白板，若活性喪失，可初步判斷起溶纖作用的物質(zhì)為蛋白質(zhì)。

1.2.3.2樣品蛋白溶液酶活力測定

分別取10μL接骨木、苦碟子蛋白質(zhì)提取液，加入纖維平板中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，觀察，如點樣孔周圍出現(xiàn)透明的溶圈，則證明被加樣品有溶栓效果，測量溶圈直徑，對照標準曲線可得到樣品溶液相對尿激酶活力。

1.2.3.3蛋白提取物的溶纖比活力測定

蛋白比活力（U/mg）=相對尿激酶活力（U）/[蛋白濃度（mg/mL）×點樣體積（mL）]。

1.2.4接骨木、苦碟子纖溶酶的SDS-PAGE檢測

按汪家政等的方法[9]，對蛋白質(zhì)進行12%SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍G-250染色。

2結(jié)果與分析

2.1接骨木、苦碟子粗酶提取液蛋白質(zhì)含量的測定

根據(jù)標準蛋白的吸光度，繪制蛋白質(zhì)濃度的標準曲線（圖1），由標準曲線得到蛋白質(zhì)濃度的計算公式為：y=0.0074x-0.0102。依據(jù)公式通過吸光度測得接骨木、苦碟子粗酶蛋白含量分別為1842μg/g及1976μg/g。

2.2接骨木、苦碟子粗酶提取物蛋白成分鑒定及溶纖活力、比活力

根據(jù)尿激酶溶圈直徑的平方繪制尿激酶標準曲線（圖

2），由標準曲線得到酶活力計算公式為y=0.0102x+0.032。根據(jù)公式，由樣品蛋白在纖維平板上的溶圈直徑計算出接骨木及苦碟子粗提物蛋白比活力為分別0.795U及0.837U。

2.3接骨木、苦碟子粗酶提取物硫酸銨分級沉淀及體外溶栓試驗

由圖3-A可見，從接骨木、苦碟子中可以分離出具有溶纖活性的纖溶蛋白。硫酸銨沉淀試驗結(jié)果表明，當硫酸銨飽和度在0～40%時，沉淀物無纖溶活性；當硫酸銨飽和度在50%～60%時，沉淀物活性較低；而當硫酸銨飽和度為70%～90%，沉淀物活性最高（圖3-B），因此，后續(xù)試驗均采取70%～90%飽和硫酸銨沉淀。

2.4接骨木、苦碟子粗酶提取物蛋白成分鑒定

將提取到的接骨木、苦碟子粗酶提取物在沸水中煮沸5min，將煮沸后的樣品進行溶纖試驗，纖維平板上未見任何溶解現(xiàn)象，表明接骨木、苦碟子中具有溶栓作用的為蛋白質(zhì)。

2.5接骨木、苦碟子纖溶酶的SDS-PAGE檢測

對得到的接骨木、苦碟子粗酶進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，從這2種長白山道地藥材中可分離到分子量為15～45ku的蛋白質(zhì)（圖4），經(jīng)離子交換層析后，得到分子量大約為36ku的明顯條帶（圖5），因此，初步判斷接骨木、苦碟子纖溶蛋白酶的分子量大約為36ku。endprint

3討論

隨著人們生活水平的不斷提高，血栓性疾病已成為常見病、多發(fā)病，尤其是心腦血管疾病，嚴重影響人類的健康和壽命。目前預(yù)防和治療血栓性疾病主要有3種方式：一是針對一些有高凝狀態(tài)的病人用藥物預(yù)防血栓；二是對已有血栓形成的患者給予抗凝治療，以防止血栓的延伸、擴大，避免栓塞并發(fā)癥；三是采用手術(shù)或服用溶栓藥物，消除血栓，疏通血管，恢復(fù)正常血液流動，減少組織和臟器的損傷。前2種方式對于已經(jīng)形成的血栓無法消除，而手術(shù)取血栓技術(shù)的難度和風(fēng)險都較大，所以在臨床上多采用溶栓藥物法。溶栓藥物以溶解纖維蛋白多聚體為主，使血栓纖維蛋白降解，形成可溶性的纖維蛋白降解產(chǎn)物，及時使血管再通，減輕臟器損害的范圍和程度，大大提高病人的存活率。纖溶系統(tǒng)對纖維蛋白的溶解、對血液的循環(huán)有重要的影響，纖溶酶活性的降低是導(dǎo)致血栓形成的主要原因之一。目前纖溶酶主要來源于動物和微生物，源于植物的纖溶酶很少[10]。本試驗從接骨木、苦碟子中分離得到纖溶酶并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了初步研究，表明可以從接骨木、苦碟子中分離出分子量約為36ku的具有溶栓活性的纖溶酶，有望將其開發(fā)成新型的溶栓類藥物。

參考文獻：

[1]徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1347-1348.

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[8]夏廣清，宋金枝，劉偉.穿龍薯蕷纖溶酶分離及活性檢測[J].通化師范學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)，2013，34（2）：42-43，86.

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[10]顧昌玲，朱寶成，周艷芬，等.延胡索纖溶酶的分離純化及部分性質(zhì)[J].中國生化藥物雜志，2008，29（2）：81-84，88.endprint

3討論

隨著人們生活水平的不斷提高，血栓性疾病已成為常見病、多發(fā)病，尤其是心腦血管疾病，嚴重影響人類的健康和壽命。目前預(yù)防和治療血栓性疾病主要有3種方式：一是針對一些有高凝狀態(tài)的病人用藥物預(yù)防血栓；二是對已有血栓形成的患者給予抗凝治療，以防止血栓的延伸、擴大，避免栓塞并發(fā)癥；三是采用手術(shù)或服用溶栓藥物，消除血栓，疏通血管，恢復(fù)正常血液流動，減少組織和臟器的損傷。前2種方式對于已經(jīng)形成的血栓無法消除，而手術(shù)取血栓技術(shù)的難度和風(fēng)險都較大，所以在臨床上多采用溶栓藥物法。溶栓藥物以溶解纖維蛋白多聚體為主，使血栓纖維蛋白降解，形成可溶性的纖維蛋白降解產(chǎn)物，及時使血管再通，減輕臟器損害的范圍和程度，大大提高病人的存活率。纖溶系統(tǒng)對纖維蛋白的溶解、對血液的循環(huán)有重要的影響，纖溶酶活性的降低是導(dǎo)致血栓形成的主要原因之一。目前纖溶酶主要來源于動物和微生物，源于植物的纖溶酶很少[10]。本試驗從接骨木、苦碟子中分離得到纖溶酶并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了初步研究，表明可以從接骨木、苦碟子中分離出分子量約為36ku的具有溶栓活性的纖溶酶，有望將其開發(fā)成新型的溶栓類藥物。

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3討論

隨著人們生活水平的不斷提高，血栓性疾病已成為常見病、多發(fā)病，尤其是心腦血管疾病，嚴重影響人類的健康和壽命。目前預(yù)防和治療血栓性疾病主要有3種方式：一是針對一些有高凝狀態(tài)的病人用藥物預(yù)防血栓；二是對已有血栓形成的患者給予抗凝治療，以防止血栓的延伸、擴大，避免栓塞并發(fā)癥；三是采用手術(shù)或服用溶栓藥物，消除血栓，疏通血管，恢復(fù)正常血液流動，減少組織和臟器的損傷。前2種方式對于已經(jīng)形成的血栓無法消除，而手術(shù)取血栓技術(shù)的難度和風(fēng)險都較大，所以在臨床上多采用溶栓藥物法。溶栓藥物以溶解纖維蛋白多聚體為主，使血栓纖維蛋白降解，形成可溶性的纖維蛋白降解產(chǎn)物，及時使血管再通，減輕臟器損害的范圍和程度，大大提高病人的存活率。纖溶系統(tǒng)對纖維蛋白的溶解、對血液的循環(huán)有重要的影響，纖溶酶活性的降低是導(dǎo)致血栓形成的主要原因之一。目前纖溶酶主要來源于動物和微生物，源于植物的纖溶酶很少[10]。本試驗從接骨木、苦碟子中分離得到纖溶酶并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了初步研究，表明可以從接骨木、苦碟子中分離出分子量約為36ku的具有溶栓活性的纖溶酶，有望將其開發(fā)成新型的溶栓類藥物。

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