檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝研究

于麗穎+成樂琴

摘要：以水解前后大豆異黃酮糖苷含量變化計算水解率為評價指標，采用單因素和正交試驗法對水解的工藝條件進行優化。結果表明，檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元最佳工藝為：反應溫度127℃，反應時間為1.8h，檸檬酸水溶液濃度為1.6mol/L，水解率達到90%以上。

關鍵詞：大豆異黃酮糖苷；大豆異黃酮苷元；水解；檸檬酸；正交試驗

中圖分類號：O629.13文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0294-03

大豆異黃酮的健康功效多種多樣，可以預防多種疾病和改善骨健康狀況[1]。大豆中天然存在的異黃酮包括大豆異黃酮糖苷和大豆異黃酮苷元2類，其中，大豆異黃酮糖苷占到了總異黃酮含量的80%～95%，糖苷型大豆異黃酮由于分子較大，食用后不能被人體直接吸收，一般是在體內消化酶作用下轉化為苷元被人體吸收，因此大豆異黃酮的生物活性主要是苷元，而不是糖苷，但目前各種類型保健品大豆異黃酮主要成分是糖苷，資料顯示，體內消化酶一般水解率在20%～40%，產品功效較低[2-3]。另外，每個人腸道消化酶不太一樣，即使食用同樣的大豆異黃酮，個體間效果相差很大。因此體外水解工藝開發就具有實際意義。

目前，大豆異黃酮糖苷轉化苷元的方法最常用的是酸催化法、堿催化法、酶催化法[4-6]。酸水解法是大豆異黃酮糖苷水解中使用最多的一種方法。酸水解通常用鹽酸、硫酸作催化劑，強酸條件下水解會影響大豆異黃酮苷元的穩定性。糖苷鍵具有縮醛結構，對堿較穩定，異黃酮糖苷鍵具有酯苷性質，可用堿水解為大豆異黃酮苷元和葡萄糖，堿催化產物苷元容易降解，應用受到很大限制。酶水解法具有水解條件溫和，產物穩定性好，純度高等特點，但酶生產成本很高，而且酶不容易重復利用。工業生產中還需要進一步尋找廉價又高效能夠水解大豆異黃酮的β-葡萄糖苷酶，并進一步研究低成本酶固化技術。

檸檬酸是人體內部循環的重要中間產物，易被人體吸收，因此作為性能優異的食品添加劑和功能性食品廣泛應用于食品、化妝品、醫療和保健品等領域。用檸檬酸做催化劑來催化大豆異黃酮糖苷的水解，避免目前工業上采用酸、堿等水解方法對設備的腐蝕，水解產物無需分離直接用于功能性食品，能夠將無效或低效成分大豆異黃酮糖苷變為有效和高效成分大豆異黃酮苷元，增強了大豆異黃酮的生物活性，彌補了現有大豆異黃酮轉化苷元工藝中選用鹽酸催化、堿催化和酶催化等技術缺陷，因此是一條應用價值較高工藝路線。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大豆異黃酮糖苷標樣：大豆苷，黃豆黃苷、染料木苷（天津馬克生物有限公司公司），含量超過98%。糖苷型大豆異黃酮提取物（西安金綠生物工程公司），含量為91.3%。甲醇為色譜純，檸檬酸（AR），乙醚（AR）。

1.2主要儀器

高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；分析天平（北京醫用天平廠）；CS101-3型電熱鼓風干燥箱（重慶實驗設備廠）；KQ-250VDE型雙頻數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3試驗步驟

稱取大豆異黃酮糖苷50mg置于50mL圓底燒瓶中，加入一定濃度檸檬酸水溶液10mL，超聲水浴1h，超聲頻率45kHz，水浴溫度75℃。反應液轉移到高壓釜中，反應溫度為110～130℃，反應時間為0.5～2h，反應結束后，冷卻反應液至室溫。取一定量反應液用飽和碳酸鈉水溶液中和至pH值=7，用乙酸乙酯萃取，取酯層，在硅膠板上點樣，放入展開劑（乙酸乙酯∶三氯甲烷∶甲醇=5∶5∶2）中展開，紫外燈下觀察水解程度；另取一定量反應液用甲醇稀釋到100mg/L，過0.45μm濾膜后上機，用HPLC定性和定量檢測反應液中糖苷的含量。

1.4高效液相色譜法（HPLC）測定糖苷及其苷元的含量

1.4.1色譜條件

色譜柱：ShimadzuVP-ODSC18柱，150mm×4.6mm，5μm；流動相：A為0.4%磷酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～10min，30%～35%B；10～20min，35%～40%B；20～30min，40%～55%B；30～40min，55%～65%B；流速：1mL/min；檢測波長為：260nm，測定溫度為30℃；進樣量：20μL。

根據糖苷和苷元化學性質的不同，從色譜柱中流出的先后順序不同，經紫外檢測器測定，通過與標準品比較，以保留時間定性，峰面積定量，外標法計算。

大豆異黃酮糖苷水解率=水解前后大豆異黃酮糖苷含量之差/水解前大豆異黃酮糖苷含量×100%。

1.4.2標準曲線的繪制

精確稱取一定量大豆異黃酮糖苷標準品于100mL的容量瓶中，用甲醇超聲溶解30min，再用甲醇定容至刻度線，搖勻，分別精確吸取上述標準溶液1、2、3、4、5mL，用甲醇定容至25mL，配制成10、20、30、40、50μg/mL的系列標準溶液，搖勻，備用。

用HPLC法分別測定配制的系列標準溶液，進樣量20μL，每個濃度平行測定3次。以峰面積平均值為縱坐標，濃度為橫坐標，峰面積A對濃度C（μg/mL）進行回歸分析，得到線性方程。

回歸方程分別為：

大豆苷：A=78.576C+39.121，r=0.9999；

黃豆黃苷：A=69.321C+33.867，r=0.9998；

染料木苷：A=99.671C+35.586，r=0.9999。

式中：A為大豆異黃酮的峰面積：C為大豆異黃酮的濃度，μg/mL，線性范圍是10～50μg/mL。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1不同反應溫度對大豆異黃酮水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，檸檬酸催化劑濃度為1.6mol/L，溶劑用量為10mL，反應時間為2h，改變反應溫度，探索不同反應溫度對大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗結果（表1）表明，隨著溫度增加，水解率逐漸增加。當反應溫度為125℃，水解率達到90.5%，一般大豆異黃酮糖苷在人體消化酶作用下，水解率為20%左右，大豆異黃酮糖苷水解率達到90%更具有實際意義。因此，在單因素水解反應試驗中，適宜溫度為125℃。為了進一步考察反應溫度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應溫度分別為123、125、127℃進行正交試驗。endprint

2.1.2不同檸檬酸水溶液濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，反應溫度為125℃，反應時間為2h，溶劑用量為10mL，改變催化劑檸檬酸水溶液的濃度，探索催化劑濃度對大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗結果（表2）表明，隨催化劑檸檬酸水溶液濃度的增加，水解率逐漸增加；當檸檬酸濃度為1.6mol/L時，水解率為90.5%。再增加酸濃度，水解率有所降低，可能的原因，檸檬酸為有機弱酸，適宜的濃度酸性較強，濃度過大會抑制其電離，從而減弱酸性，所以適宜的檸檬酸濃度為1.6mol/L。為了進一步考察催化劑濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇檸檬酸濃度分別為1.4、1.6、1.8mol/L進行正交試驗。

2.1.3不同反應時間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，催化劑濃度為1.8mol/L，反應溫度為125℃，溶劑用量為10mL，改變反應時間，探索不同反應時間對大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗結果（表3）表明，隨反應時間增加，水解率也逐漸增加；當反應時間為1.6h，水解率接近90%，延長時間，水解率變化不大。為了進一步考察反應時間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應時間分別為1.4、1.6、1.8h進行正交試驗。

2.2正交試驗

根據單因素試驗結果，大豆異黃酮糖苷水解苷元主要影響因素包括催化劑濃度、反應時間和反應溫度，根據正交試驗影響因素構建正交試驗表進一步確立水解反應的最佳工藝條件。

2.2.1因素及水平的考察

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗方法，優化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝。以水

解率為考察指標，選擇反應時間（1.4、1.6、1.8h）、反應溫度（123、125、127℃）、檸檬酸濃度（1.4、1.6、1.8mol/L）、作為考察因素，按3因素3水平進行正交試驗設計L9（43），見表4，在此條件下對大豆異黃酮糖苷按“1.3”節方法進行水解，按“1.4”節方法，用HPLC定性和定量檢測反應液糖苷及其苷元的含量，計算水解率，確定大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝。

2.2.2正交試驗結果

正交試驗結果見表5。從表5的極差分析結果可知，3因素對水解率的影響程度依次為B>A>C，3因素的最佳水平組合為A3B3C2，即檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝條件為：反應溫度127℃，反應時間為1.8h，檸檬酸水溶液濃度為1.6mol/L，水解率達到90%以上。表6的方差分析結果表明，水解溫度和水解時間對大豆異黃酮糖苷的水解效果具有顯著影響。

2.3最佳工藝驗證試驗

為了考察上述優選工藝的穩定性，按該工藝條件重復提取3次，測得大豆異黃酮糖苷的水解率分別為92.8%、91.3%、92.5%，平均為92.2%，表明本試驗優選的工藝穩定可靠。

3結論

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝條件，以大豆異黃酮糖苷的水解率作為評價指標，得出各因素對水解效果影響的主次順序依次為反應溫度>反應時間>檸檬酸水溶液濃度。通過極差分析可知，反應溫度對水解率影響顯著。大豆異黃酮糖苷水解的最佳工藝條件為反應溫度127℃，反應時間1.8h，催化劑檸檬酸水溶液濃度1.6mol/L，在此條件下所得的大豆異黃酮糖苷水解率達到90%以上。

本研究成功探索出一條簡便、清潔、成本較低，水解產物無需后處理直接用于功能性食品的綠色合成工藝路線，彌補了現有工藝中的技術缺陷，因此實用性較高。

參考文獻：

[1]KuoLC，LeeKT.Cloning，Expression，andcharacterizationoftwobeta-glucosidasesfromisoflavoneglycoside-hydrolyzingBacillussubtilis（natto）[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2008，56（1）：119-125.

[2]KawakamiY，TsurugasakiW，NakamuraS，etal.Comparisonofregulativefunctionsbetweendietarysoyisoflavonesaglyconeandglucosideonlipidmetabolisminratsfedcholesterol[J].TheJournalofNutritionalBiochemistry，2005，16（4）：205-212.

[3]SetchellKR，CassidyA.Dietaryisofravones：biologicaleffectsandrelevancetohumanhealthy[J].JournalofNutrition，1999，129：758-767.

[4]高榮海，鄭艷，劉長江.大豆異黃酮糖苷酸法水解工藝的研究[J].糧食加工，2008，33（1）：54-57.

[5]孫艷梅，張永忠，許晶，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷研究[J].東北農業大學學報，2007，38（1）：9-12.

[6]王林山.大豆異黃酮的研究進展[J].中國食物與營養，2004（11）：18-21.endprint

2.1.2不同檸檬酸水溶液濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，反應溫度為125℃，反應時間為2h，溶劑用量為10mL，改變催化劑檸檬酸水溶液的濃度，探索催化劑濃度對大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗結果（表2）表明，隨催化劑檸檬酸水溶液濃度的增加，水解率逐漸增加；當檸檬酸濃度為1.6mol/L時，水解率為90.5%。再增加酸濃度，水解率有所降低，可能的原因，檸檬酸為有機弱酸，適宜的濃度酸性較強，濃度過大會抑制其電離，從而減弱酸性，所以適宜的檸檬酸濃度為1.6mol/L。為了進一步考察催化劑濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇檸檬酸濃度分別為1.4、1.6、1.8mol/L進行正交試驗。

2.1.3不同反應時間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，催化劑濃度為1.8mol/L，反應溫度為125℃，溶劑用量為10mL，改變反應時間，探索不同反應時間對大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗結果（表3）表明，隨反應時間增加，水解率也逐漸增加；當反應時間為1.6h，水解率接近90%，延長時間，水解率變化不大。為了進一步考察反應時間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應時間分別為1.4、1.6、1.8h進行正交試驗。

2.2正交試驗

根據單因素試驗結果，大豆異黃酮糖苷水解苷元主要影響因素包括催化劑濃度、反應時間和反應溫度，根據正交試驗影響因素構建正交試驗表進一步確立水解反應的最佳工藝條件。

2.2.1因素及水平的考察

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗方法，優化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝。以水

解率為考察指標，選擇反應時間（1.4、1.6、1.8h）、反應溫度（123、125、127℃）、檸檬酸濃度（1.4、1.6、1.8mol/L）、作為考察因素，按3因素3水平進行正交試驗設計L9（43），見表4，在此條件下對大豆異黃酮糖苷按“1.3”節方法進行水解，按“1.4”節方法，用HPLC定性和定量檢測反應液糖苷及其苷元的含量，計算水解率，確定大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝。

2.2.2正交試驗結果

正交試驗結果見表5。從表5的極差分析結果可知，3因素對水解率的影響程度依次為B>A>C，3因素的最佳水平組合為A3B3C2，即檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝條件為：反應溫度127℃，反應時間為1.8h，檸檬酸水溶液濃度為1.6mol/L，水解率達到90%以上。表6的方差分析結果表明，水解溫度和水解時間對大豆異黃酮糖苷的水解效果具有顯著影響。

2.3最佳工藝驗證試驗

為了考察上述優選工藝的穩定性，按該工藝條件重復提取3次，測得大豆異黃酮糖苷的水解率分別為92.8%、91.3%、92.5%，平均為92.2%，表明本試驗優選的工藝穩定可靠。

3結論

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝條件，以大豆異黃酮糖苷的水解率作為評價指標，得出各因素對水解效果影響的主次順序依次為反應溫度>反應時間>檸檬酸水溶液濃度。通過極差分析可知，反應溫度對水解率影響顯著。大豆異黃酮糖苷水解的最佳工藝條件為反應溫度127℃，反應時間1.8h，催化劑檸檬酸水溶液濃度1.6mol/L，在此條件下所得的大豆異黃酮糖苷水解率達到90%以上。

本研究成功探索出一條簡便、清潔、成本較低，水解產物無需后處理直接用于功能性食品的綠色合成工藝路線，彌補了現有工藝中的技術缺陷，因此實用性較高。

參考文獻：

[1]KuoLC，LeeKT.Cloning，Expression，andcharacterizationoftwobeta-glucosidasesfromisoflavoneglycoside-hydrolyzingBacillussubtilis（natto）[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2008，56（1）：119-125.

[2]KawakamiY，TsurugasakiW，NakamuraS，etal.Comparisonofregulativefunctionsbetweendietarysoyisoflavonesaglyconeandglucosideonlipidmetabolisminratsfedcholesterol[J].TheJournalofNutritionalBiochemistry，2005，16（4）：205-212.

[3]SetchellKR，CassidyA.Dietaryisofravones：biologicaleffectsandrelevancetohumanhealthy[J].JournalofNutrition，1999，129：758-767.

[4]高榮海，鄭艷，劉長江.大豆異黃酮糖苷酸法水解工藝的研究[J].糧食加工，2008，33（1）：54-57.

[5]孫艷梅，張永忠，許晶，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷研究[J].東北農業大學學報，2007，38（1）：9-12.

[6]王林山.大豆異黃酮的研究進展[J].中國食物與營養，2004（11）：18-21.endprint

2.1.2不同檸檬酸水溶液濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，反應溫度為125℃，反應時間為2h，溶劑用量為10mL，改變催化劑檸檬酸水溶液的濃度，探索催化劑濃度對大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗結果（表2）表明，隨催化劑檸檬酸水溶液濃度的增加，水解率逐漸增加；當檸檬酸濃度為1.6mol/L時，水解率為90.5%。再增加酸濃度，水解率有所降低，可能的原因，檸檬酸為有機弱酸，適宜的濃度酸性較強，濃度過大會抑制其電離，從而減弱酸性，所以適宜的檸檬酸濃度為1.6mol/L。為了進一步考察催化劑濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇檸檬酸濃度分別為1.4、1.6、1.8mol/L進行正交試驗。

2.1.3不同反應時間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，催化劑濃度為1.8mol/L，反應溫度為125℃，溶劑用量為10mL，改變反應時間，探索不同反應時間對大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗結果（表3）表明，隨反應時間增加，水解率也逐漸增加；當反應時間為1.6h，水解率接近90%，延長時間，水解率變化不大。為了進一步考察反應時間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應時間分別為1.4、1.6、1.8h進行正交試驗。

2.2正交試驗

根據單因素試驗結果，大豆異黃酮糖苷水解苷元主要影響因素包括催化劑濃度、反應時間和反應溫度，根據正交試驗影響因素構建正交試驗表進一步確立水解反應的最佳工藝條件。

2.2.1因素及水平的考察

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗方法，優化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝。以水

解率為考察指標，選擇反應時間（1.4、1.6、1.8h）、反應溫度（123、125、127℃）、檸檬酸濃度（1.4、1.6、1.8mol/L）、作為考察因素，按3因素3水平進行正交試驗設計L9（43），見表4，在此條件下對大豆異黃酮糖苷按“1.3”節方法進行水解，按“1.4”節方法，用HPLC定性和定量檢測反應液糖苷及其苷元的含量，計算水解率，確定大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝。

2.2.2正交試驗結果

正交試驗結果見表5。從表5的極差分析結果可知，3因素對水解率的影響程度依次為B>A>C，3因素的最佳水平組合為A3B3C2，即檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝條件為：反應溫度127℃，反應時間為1.8h，檸檬酸水溶液濃度為1.6mol/L，水解率達到90%以上。表6的方差分析結果表明，水解溫度和水解時間對大豆異黃酮糖苷的水解效果具有顯著影響。

2.3最佳工藝驗證試驗

為了考察上述優選工藝的穩定性，按該工藝條件重復提取3次，測得大豆異黃酮糖苷的水解率分別為92.8%、91.3%、92.5%，平均為92.2%，表明本試驗優選的工藝穩定可靠。

3結論

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝條件，以大豆異黃酮糖苷的水解率作為評價指標，得出各因素對水解效果影響的主次順序依次為反應溫度>反應時間>檸檬酸水溶液濃度。通過極差分析可知，反應溫度對水解率影響顯著。大豆異黃酮糖苷水解的最佳工藝條件為反應溫度127℃，反應時間1.8h，催化劑檸檬酸水溶液濃度1.6mol/L，在此條件下所得的大豆異黃酮糖苷水解率達到90%以上。

本研究成功探索出一條簡便、清潔、成本較低，水解產物無需后處理直接用于功能性食品的綠色合成工藝路線，彌補了現有工藝中的技術缺陷，因此實用性較高。

參考文獻：

[1]KuoLC，LeeKT.Cloning，Expression，andcharacterizationoftwobeta-glucosidasesfromisoflavoneglycoside-hydrolyzingBacillussubtilis（natto）[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2008，56（1）：119-125.

[2]KawakamiY，TsurugasakiW，NakamuraS，etal.Comparisonofregulativefunctionsbetweendietarysoyisoflavonesaglyconeandglucosideonlipidmetabolisminratsfedcholesterol[J].TheJournalofNutritionalBiochemistry，2005，16（4）：205-212.

[3]SetchellKR，CassidyA.Dietaryisofravones：biologicaleffectsandrelevancetohumanhealthy[J].JournalofNutrition，1999，129：758-767.

[4]高榮海，鄭艷，劉長江.大豆異黃酮糖苷酸法水解工藝的研究[J].糧食加工，2008，33（1）：54-57.

[5]孫艷梅，張永忠，許晶，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷研究[J].東北農業大學學報，2007，38（1）：9-12.

[6]王林山.大豆異黃酮的研究進展[J].中國食物與營養，2004（11）：18-21.endprint