禽病源性大腸桿菌E058株neuC基因突變株的構建及致病性

徐亞亞+紀康+盧勁曄+蔣珊珊+郝福星

摘要：運用Red重組系統構建E058ΔneuC基因缺失突變株。細菌生長曲線結果，突變株E058ΔneuC比野生株E058的生長速度稍慢。在血清殺菌試驗中，與野生株E058相比，E058ΔneuC在血清中的存活率顯著下降。體外競爭結果表明，突變株E058ΔneuC毒力被輕度的致弱。體內動態分布試驗中，E058ΔneuC突變株在受檢臟器中的細菌數較APECE058株均明顯下降，在心、肝、脾、腎中極顯著下降，在肺中也極顯著下降。結果表明，neuC基因與APECE058株的致病性有較強關聯性。

關鍵詞：禽病源性大腸桿菌；neuC基因；突變株；致病性

中圖分類號：S852.61+2文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0234-03

禽大腸桿菌病由禽源性大腸桿菌引起，造成局部或全身性感染，包括大腸桿菌性蜂窩織炎（炎性過程）、Hjarre氏病（肉芽腫）、敗血癥、氣囊病、腹膜炎、滑膜炎/骨髓炎、臍炎/卵黃囊感染、腫頭綜合征、輸卵管炎、全眼球炎等，大腸桿菌病對養禽業造成嚴重的經濟損失，在禽病調查中疾病是胴體報廢的主要原因，禽肉加工中43%肉雞胴體的報廢與大腸桿菌病有關[1-2]。禽病原性大腸桿菌致病相關的毒力因子已相繼報道，如Ι型菌毛、P菌毛、莢膜、脂多糖復合物、鐵攝取系統（氣桿菌素、鐵系統和耶爾森氏菌強毒力島等）[3-4]、空泡形成毒素（vacuolatingautotransportertoxin，VAT）[5-6]、侵襲素IbeA[7]等。[LL]禽大腸桿菌病不僅有復雜的致病機理，而且部分的毒力因子功能還有待進一步明確。

本研究從我國分離的禽病原性大腸桿菌E058株（O2血清型）在芯片雜交試驗中獲得的表達差異片段中選取neuC基因片段為研究對象[8]，構建E058ΔneuC突變株，通過動物試驗，探討基因neuC和E058株致病性之間的關系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質粒菌株和質粒見表1。

1.1.3主要試劑

TaqDNAPolymerase、T4連接酶、DNaseⅠ購自Fermentas公司；dNTP、DNA限制性內切酶、DNAmarker購自大連TaKaRa公司；PCRcleanupkit、AgaroseGelDNAPurificationKit購自杭州AXYGEN公司；SDS、NaAc、EDTA、ATP、Casaminoacids，2′，2′-dipyridyl購自Sigma公司；L-阿拉伯糖購自BioBasic公司；Tryptone、Yeastextract為Oxoid產品；其他試劑均為國產分析純級產品；抗生素使用濃度為：氨芐青霉素60μg/mL、卡那霉素50μg/mL。

1.1.4試驗雞

SPF雞由北京梅里亞維通試驗動物技術有限公司提供，SPF種蛋本室自行孵化。

1.2方法

1.2.1分子生物學及數據分析軟件

PrimerPremier5.0引物設計軟件；Lasergene序列分析軟件；GraphPadPrism5數據分析軟件。

1.2.2T-neuC-Kan重組質粒的構建

以E058野生株基因組DNA為模板，采用普通PCR擴增neuC基因。應用neuC-F/neuC-R引物，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR鑒定。PCR產物經鑒定是預期大小的片段，然后用AgaroseGelDNA膠回收試劑盒回收純化DNA片段。將純化回收的neuC基因片段直接克隆入pMD·18-T載體中。采用CaCl2法按《分子克隆》所述步驟進行將連接產物進行轉化，涂板，完成感受態細胞的制備，參照《分子克隆》相關步驟[9-10]進行菌落挑取，進行培養，以及提取小量的質粒；提取質粒后再進行BamHⅠ-HindⅢ雙酶切的鑒定，鑒定正確即為重組質粒T-neuC。設計1對引物，上游引物T-neuC-F的5′端引入EcoRⅠ位點；下游引物T-neuC-R的5′端引入EcoRⅠ位點。上、下游引物擴增片段約為3.2kb。以重組質粒T-neuC為模板，反向PCR擴增T-neuC片段。將純化回收反向擴增的T-neuC片段和pUC4K質粒分別用EcoRⅠ酶切。將回收的反拉T-neuC片段與酶切下來的Kan片段連接。將連接產物涂板，再挑取菌落、培養和質粒的小量提取等，質粒提取后分別用EcoRⅠ酶切鑒定，電泳鑒定，正確的質粒委托專業檢測公司完成測序驗證，測序鑒定正確的即為重組質粒T-neuC-Kan。

1.2.2電轉化親本株E058構建突變株E058ΔneuC

將PCR擴增的T-neuC-Kan片段電轉化到含有感受態細胞的E058中，通過Red重組系統構建突變株E058ΔneuC。

1.3細菌生長曲線測定

將野生株E058和突變株E058ΔneuC在LB基礎培養基中過夜培養，加入10mL的LB液體培養基中（調節D600nm=0.05）。以220r/min條件在37℃恒溫搖床中搖振培養；連續4h，每隔30min測定細菌的D600nm，繪制野生株和突變株的生長曲線，并對野生株與突變株的生長速度進行觀察。

1.4SPF雞血清的殺菌性試驗

采集SPF雞血清并充分混勻，儲存于-70℃備用。將混勻的血清用pH值7.2的PBS緩沖液稀釋為0.5%、2.5%、5%、12.5%、25%的血清懸液，以及1份25%的滅能血清（56℃金屬浴30min滅能）。取10μL菌液（含有106CFU的細菌）分別加到190μL血清懸液以及滅能血清中，37℃培養30min。取出，在普通LB平板上進行細菌掛板計數，18h后觀察細菌生長數量。

1.5體外競爭試驗

將細菌的濃度調至1×108CFU/mL，E058野生株與E058ΔneuC突變株各自以1∶1的比例混合均勻，接種于LB培養基中，37℃靜置培養4h。然后分別用無抗性的LB平板和含有kanamycin抗性的LB平板對細菌計數，18h后可以觀察到結果。競爭指數（CI）的公式計算方法是：輸出量的比率（突變株/野生株）除以輸入量的比率（突變株/野生株）。若CI值在0.1～1.0之間，表明突變株毒力被輕度致弱；如CI值在0.01～0.10之間，表明突變株毒力被中度致弱；若如CI值在0～0.01之間表明突變株毒力被高度致弱[11]。endprint

1.6體內動態分布試驗

將細菌濃度調至1×108CFU/mL，45羽35日齡的SPF雞，隨機分為3組，每組15羽，其中2組分別于左胸的氣囊接種0.25mL的E058野生株和E058ΔneuC突變株，還有1組為空白對照。接種24h后，全部撲殺，取心血及肝、脾、肺、腎，稱重后研磨，經過稀釋后用無抗性的LB固體培養基、kanamycin抗性培養基進行細菌計數，18h后觀察結果。

2結果與分析

2.1突變株E058ΔneuC的鑒定

突變株E058ΔneuC經引物neuC-F/neuC-R擴增出1700bp的條帶，而親本株E058擴增出900bp的條帶。與預期的結果相一致。

2.2生長曲線

從生長曲線上可以看出E058ΔneuC比野生株E058的生長速度稍慢（圖1）。

2.3血清殺菌

在血清殺菌試驗中，血清濃度從低到高分別為0.50%、2.50%、5.00%、12.50%、25.00%，“HI”代表的是25%的滅活血清。從圖2可以看出血清濃度為5%、12.50%、25%時突變株E058ΔneuC被輕度致弱。

2.4體外競爭

對E058、E058ΔneuC株分別細菌計數至1×108CFU，分別將等量的E058ΔneuC與E058混合于2mLLB培養基中，37℃培養4h。在有、無抗性的LB平板上，根據其計數結果，計算得到E058ΔneuC和E058的CI值為0.65。結果表明，在體外突變株E058ΔneuC毒力被輕度致弱。

2.5體內動態分布

體內動態分布結果，與E058相比，突變株E058ΔneuC的毒力極顯著被致弱（圖3）。接種24h后，親本株E058在心臟細菌檢出數量為1.2×104CFU/ml、在肝、脾、肺、腎中的細菌檢出數量為1.2×104CFU/ml、2.3×104、1.9×105、2.0×105、7.8×104CFU/g；而突變株在心臟、肝、脾、肺、腎中的細菌檢出數量為1.2CFU/mL、0.9、3.4、15、1.3CFU/g，兩者差異達極顯著水平。

3結論

禽大腸桿菌作為家禽最常見的病原菌之一，給養禽業造成嚴重的經濟損失。雖然禽大腸桿菌和致病力相關的毒力因子已經相繼報道。然而許多毒力因子是通過一系列的感染模型被證明。在自然條件下，大腸桿菌感染動物的發病機理尚未完全清楚，已知致病因子僅能用于解釋感染過程中間環節的某些步驟。

NeuC基因與莢膜形成有關，而莢膜是大腸桿菌中重要的毒力因子之一[12]。莢膜有3個區域，其中區域1、區域3主要負責將細菌胞內的高分子聚合物轉運到胞外，區域2跟莢膜的形成、激活、聚合等相關聯。而neuC基因在區域2中，莢膜能保護菌體免受宿主免疫機制的侵害以及降低巨噬細胞對細菌的吞噬[13]。

本研究中利用Red重組系統構建的E058ΔneuC突變株開展了多項相關動物試驗，評價了致病性，研究基因neuC和APECE058株致病性的關系。從生長曲線來看，E058ΔneuC突變株的生長速度稍慢。不同濃度的SPF雞血清中的E058ΔneuC突變株的存活能力有所下降，特別是濃度從5%～25%的雞血清中，與親本株比較達到顯著的差異水平；體外競爭試驗中突變株的CI值都在0.1～1.0之間，突變株輕度致弱；體內動態分布試驗結果，E058ΔneuC突變株在受檢臟器內的細菌較APECE058株均有不同程度的下降，表明突變株定植于各受檢臟器的能力減弱，進而說明突變株的毒力減弱。

綜上所述，NeuC基因與APECE058株致病性有較強的關系，并與芯片雜交結果相一致。

參考文獻：

[1]CalnekWB.禽病學[M].10版.高福，蘇敬良，譯.北京：中國農業出版社，1999.

[2]甘孟侯.中國禽病學[M].北京：中國農業出版社，1999.

[3]HarryEG，ChubbLG.RelationshipsbetweencertainbiochemicalcharacteristicsandpathologicalactivityinavianstrainsofE.coli[J].JournalofComparativePathology，1964，74：180-187.

[4]LloydAL，RaskoDA，MobleyHL.Defininggenomicislandsanduropathogen-specificgenesinuropathogenicEscherichiacoli[J].JournalofBacteriology，2007，189（9）：3532-3546.

[5]Dho-MoulinM，vandenBoschJF，GirardeauJP，etal.SurfaceantigensfromEscherichiacoliO2andO78strainsofavianorigin[J].InfectionandImmunity，1990，58（3）：740-745.

[6]NavehMW，ZusmanT，SkutelskyE，etal.AdherencepiliinavianstrainsofEscherichiacoli：effectonpathogenicity[J].AvianDiseases，1984，28（3）：651-661.

[7]WhittamTS，WilsonRA.GeneticrelationshipsamongpathogenicstrainsofavianEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，1988，56（9）：2458-2466.

[8]宦海霞，周瓊，趙李祥，等.應用DNA芯片技術研究體外表達禽致病性大腸桿菌可能致病基因[J].微生物學報，2008，48（1）：103-111.

[9]GaoS，LiuXF，ZhangRK，etal.TheisolationandidentificationofpathogenicEscherichiacoliisolatesofchickenoriginfromsomeregionsinChina[J].ActaVeterinariaetZootechnicalSinica，1999，30：164-171.

[10]LiG，LaturnusC，EwersC，etal.IdentificationofgenesrequiredforavianEscherichiacolisepticemiabysignaturetaggedmutagenesis[J].InfectionandImmunity，2005，73：2818-2827.

[11]RussoTA，McFaddenCD，Carlino-MacDonaldUB，etal.IroNfunctionsasasiderophorereceptorandisaurovirulencefactorinanextraintestinalpathogenicisolateofEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，2002，70：7156-7160.

[12]KaijserB，HansonLA，JodalV，etal.FrequencyofE.coliKantigensinurinary-tractinfectionsinchildren[J].Lancet，1977，1：664-666.

[13]RobertsIS.Bacterialpolysaccharidesinsicknessandinhealth[J].Microbiology，1995，141（9）：2023-2031.endprint

1.6體內動態分布試驗

將細菌濃度調至1×108CFU/mL，45羽35日齡的SPF雞，隨機分為3組，每組15羽，其中2組分別于左胸的氣囊接種0.25mL的E058野生株和E058ΔneuC突變株，還有1組為空白對照。接種24h后，全部撲殺，取心血及肝、脾、肺、腎，稱重后研磨，經過稀釋后用無抗性的LB固體培養基、kanamycin抗性培養基進行細菌計數，18h后觀察結果。

2結果與分析

2.1突變株E058ΔneuC的鑒定

突變株E058ΔneuC經引物neuC-F/neuC-R擴增出1700bp的條帶，而親本株E058擴增出900bp的條帶。與預期的結果相一致。

2.2生長曲線

從生長曲線上可以看出E058ΔneuC比野生株E058的生長速度稍慢（圖1）。

2.3血清殺菌

在血清殺菌試驗中，血清濃度從低到高分別為0.50%、2.50%、5.00%、12.50%、25.00%，“HI”代表的是25%的滅活血清。從圖2可以看出血清濃度為5%、12.50%、25%時突變株E058ΔneuC被輕度致弱。

2.4體外競爭

對E058、E058ΔneuC株分別細菌計數至1×108CFU，分別將等量的E058ΔneuC與E058混合于2mLLB培養基中，37℃培養4h。在有、無抗性的LB平板上，根據其計數結果，計算得到E058ΔneuC和E058的CI值為0.65。結果表明，在體外突變株E058ΔneuC毒力被輕度致弱。

2.5體內動態分布

體內動態分布結果，與E058相比，突變株E058ΔneuC的毒力極顯著被致弱（圖3）。接種24h后，親本株E058在心臟細菌檢出數量為1.2×104CFU/ml、在肝、脾、肺、腎中的細菌檢出數量為1.2×104CFU/ml、2.3×104、1.9×105、2.0×105、7.8×104CFU/g；而突變株在心臟、肝、脾、肺、腎中的細菌檢出數量為1.2CFU/mL、0.9、3.4、15、1.3CFU/g，兩者差異達極顯著水平。

3結論

禽大腸桿菌作為家禽最常見的病原菌之一，給養禽業造成嚴重的經濟損失。雖然禽大腸桿菌和致病力相關的毒力因子已經相繼報道。然而許多毒力因子是通過一系列的感染模型被證明。在自然條件下，大腸桿菌感染動物的發病機理尚未完全清楚，已知致病因子僅能用于解釋感染過程中間環節的某些步驟。

NeuC基因與莢膜形成有關，而莢膜是大腸桿菌中重要的毒力因子之一[12]。莢膜有3個區域，其中區域1、區域3主要負責將細菌胞內的高分子聚合物轉運到胞外，區域2跟莢膜的形成、激活、聚合等相關聯。而neuC基因在區域2中，莢膜能保護菌體免受宿主免疫機制的侵害以及降低巨噬細胞對細菌的吞噬[13]。

本研究中利用Red重組系統構建的E058ΔneuC突變株開展了多項相關動物試驗，評價了致病性，研究基因neuC和APECE058株致病性的關系。從生長曲線來看，E058ΔneuC突變株的生長速度稍慢。不同濃度的SPF雞血清中的E058ΔneuC突變株的存活能力有所下降，特別是濃度從5%～25%的雞血清中，與親本株比較達到顯著的差異水平；體外競爭試驗中突變株的CI值都在0.1～1.0之間，突變株輕度致弱；體內動態分布試驗結果，E058ΔneuC突變株在受檢臟器內的細菌較APECE058株均有不同程度的下降，表明突變株定植于各受檢臟器的能力減弱，進而說明突變株的毒力減弱。

綜上所述，NeuC基因與APECE058株致病性有較強的關系，并與芯片雜交結果相一致。

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[12]KaijserB，HansonLA，JodalV，etal.FrequencyofE.coliKantigensinurinary-tractinfectionsinchildren[J].Lancet，1977，1：664-666.

[13]RobertsIS.Bacterialpolysaccharidesinsicknessandinhealth[J].Microbiology，1995，141（9）：2023-2031.endprint

1.6體內動態分布試驗

將細菌濃度調至1×108CFU/mL，45羽35日齡的SPF雞，隨機分為3組，每組15羽，其中2組分別于左胸的氣囊接種0.25mL的E058野生株和E058ΔneuC突變株，還有1組為空白對照。接種24h后，全部撲殺，取心血及肝、脾、肺、腎，稱重后研磨，經過稀釋后用無抗性的LB固體培養基、kanamycin抗性培養基進行細菌計數，18h后觀察結果。

2結果與分析

2.1突變株E058ΔneuC的鑒定

突變株E058ΔneuC經引物neuC-F/neuC-R擴增出1700bp的條帶，而親本株E058擴增出900bp的條帶。與預期的結果相一致。

2.2生長曲線

從生長曲線上可以看出E058ΔneuC比野生株E058的生長速度稍慢（圖1）。

2.3血清殺菌

在血清殺菌試驗中，血清濃度從低到高分別為0.50%、2.50%、5.00%、12.50%、25.00%，“HI”代表的是25%的滅活血清。從圖2可以看出血清濃度為5%、12.50%、25%時突變株E058ΔneuC被輕度致弱。

2.4體外競爭

對E058、E058ΔneuC株分別細菌計數至1×108CFU，分別將等量的E058ΔneuC與E058混合于2mLLB培養基中，37℃培養4h。在有、無抗性的LB平板上，根據其計數結果，計算得到E058ΔneuC和E058的CI值為0.65。結果表明，在體外突變株E058ΔneuC毒力被輕度致弱。

2.5體內動態分布

體內動態分布結果，與E058相比，突變株E058ΔneuC的毒力極顯著被致弱（圖3）。接種24h后，親本株E058在心臟細菌檢出數量為1.2×104CFU/ml、在肝、脾、肺、腎中的細菌檢出數量為1.2×104CFU/ml、2.3×104、1.9×105、2.0×105、7.8×104CFU/g；而突變株在心臟、肝、脾、肺、腎中的細菌檢出數量為1.2CFU/mL、0.9、3.4、15、1.3CFU/g，兩者差異達極顯著水平。

3結論

禽大腸桿菌作為家禽最常見的病原菌之一，給養禽業造成嚴重的經濟損失。雖然禽大腸桿菌和致病力相關的毒力因子已經相繼報道。然而許多毒力因子是通過一系列的感染模型被證明。在自然條件下，大腸桿菌感染動物的發病機理尚未完全清楚，已知致病因子僅能用于解釋感染過程中間環節的某些步驟。

NeuC基因與莢膜形成有關，而莢膜是大腸桿菌中重要的毒力因子之一[12]。莢膜有3個區域，其中區域1、區域3主要負責將細菌胞內的高分子聚合物轉運到胞外，區域2跟莢膜的形成、激活、聚合等相關聯。而neuC基因在區域2中，莢膜能保護菌體免受宿主免疫機制的侵害以及降低巨噬細胞對細菌的吞噬[13]。

本研究中利用Red重組系統構建的E058ΔneuC突變株開展了多項相關動物試驗，評價了致病性，研究基因neuC和APECE058株致病性的關系。從生長曲線來看，E058ΔneuC突變株的生長速度稍慢。不同濃度的SPF雞血清中的E058ΔneuC突變株的存活能力有所下降，特別是濃度從5%～25%的雞血清中，與親本株比較達到顯著的差異水平；體外競爭試驗中突變株的CI值都在0.1～1.0之間，突變株輕度致弱；體內動態分布試驗結果，E058ΔneuC突變株在受檢臟器內的細菌較APECE058株均有不同程度的下降，表明突變株定植于各受檢臟器的能力減弱，進而說明突變株的毒力減弱。

綜上所述，NeuC基因與APECE058株致病性有較強的關系，并與芯片雜交結果相一致。

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[7]WhittamTS，WilsonRA.GeneticrelationshipsamongpathogenicstrainsofavianEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，1988，56（9）：2458-2466.

[8]宦海霞，周瓊，趙李祥，等.應用DNA芯片技術研究體外表達禽致病性大腸桿菌可能致病基因[J].微生物學報，2008，48（1）：103-111.

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[10]LiG，LaturnusC，EwersC，etal.IdentificationofgenesrequiredforavianEscherichiacolisepticemiabysignaturetaggedmutagenesis[J].InfectionandImmunity，2005，73：2818-2827.

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[12]KaijserB，HansonLA，JodalV，etal.FrequencyofE.coliKantigensinurinary-tractinfectionsinchildren[J].Lancet，1977，1：664-666.

[13]RobertsIS.Bacterialpolysaccharidesinsicknessandinhealth[J].Microbiology，1995，141（9）：2023-2031.endprint