3種麥類土傳花葉病毒的多抗制備及檢測應用

任春梅+程兆榜+朱慧+邰麗娟+陸鳳霞+鮑傳華+范永堅+周益軍

摘要：采用PEG二次沉淀和蔗糖硫酸銫密度梯度離心，得到提純的3種麥類土傳花葉病毒（小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、中國小麥花葉病毒）。透射電鏡觀察分別可見線狀、直桿狀病毒粒子，測定濃度分別達5.44、8.08、4.09mg/mL。提純病毒免疫新西蘭大白兔制備抗血清，得到的3株抗血清經酶聯免疫吸附法測定效價分別達1∶12800、1∶25600、1∶6400。應用樣品和多抗稀釋的方陣試驗，建立3種多抗的雙抗夾心酶聯免疫吸附法（TAS-ELISA），并對采自江蘇省、安徽省、河南省、山東省的麥子病樣進行檢測，結果顯示，陽性檢出率較高，說明這3種病毒仍是我國麥子流行的主要病毒。

關鍵詞：小麥黃花葉病毒；大麥黃花葉病毒；中國小麥花葉病毒；抗血清制備；血清學檢測

中圖分類號：S435.121.4+9文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0143-03

小麥黃花葉病毒（wheatyellowmosaicvirus，WYMV）、大麥黃花葉病毒（barleyyellowmosaicvirus，BaYMV）、中國小麥花葉病毒（Chinesewheatmosaicvirus，CWMV）是3種典型的麥類土傳病毒，其引起的麥類土傳病害嚴重影響麥子的產量及品質，三者均由土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxagraminis）傳播，前兩者屬于大麥黃花葉病毒屬（Bymovirus），CWMV屬于真菌傳桿狀病毒屬（Furovirus）[1]。WYMV主要分布于日本、韓國、中國[2]，BaYMV主要分布在日本、西北歐、中國，近年來在我國長江中下游及淮河地區發生較為嚴重[3-4]。分子生物學檢測技術靈敏度高但操作繁瑣且花費大，血清學方法操作簡單且一次性可以處理大量樣品而應用較為廣泛，但其核心抗體價格比較昂貴且質量要求比較高。本研究以提純的3種麥類土傳病毒的病毒粒子為抗原，制備3種病毒的多克隆抗體，并以制備的抗體建立了3種病毒的TAS-ELISA方法，對田間樣品進行了檢測應用，旨在為此類病毒診斷、抗病品種選育等提供依據。

1材料與方法

1.1材料

WYMV、CWMV、BaYMV來自江蘇省農業科學院試驗病圃中有典型癥狀的小麥、大麥葉片，病圃原始病土分別來源于江蘇省高郵市（WYMV）、江蘇省鹽城市（BaYMV）、江蘇省大豐市（CWMV），病葉-20℃保存。RSV、RBSDV毒源由筆者所在實驗室鑒定保存。試驗用兔為飼養于江蘇省農業科學院畜牧研究所兔場的新西蘭大白兔。弗氏佐劑購于Sigma公司。堿性磷酸酯酶標記的第二抗體購于美國Agdia公司。超純蔗糖、硫酸銫購于上海生工生物有限公司。BeckmanOptimaL-100XP超速離心機，其他生化試劑為國產分析純。

1.2方法

1.2.1病毒的提純

取小麥、大麥3種病毒病葉各400g，剪碎加3×抽提緩沖液，攪拌機攪碎，2層紗布過濾。加1/4濾液體積的CCl4，冰浴攪拌5min，靜置10min，8000r/min離心15min。取上清，加6%PEG-6000、3%NaCl、1%TritonX-100，冰浴攪拌至全部溶解，4℃下放置6h或過夜。8000r/min離心20min，沉淀用懸浮緩沖液懸浮，10000r/min離心15min，取上清。上清加5mL30%蔗糖墊（含0.3%TritonX-100），25000r/min離心2h。沉淀用懸浮緩沖液懸浮，12000r/min離心10min，取上清。采用蔗糖硫酸銫不連續密度梯度離心法進一步純化，22000r/min離心3h。離心管上端1/3處為病毒層，用樣品緩沖液稀釋，40000r/min離心1h。用0.5mL樣品緩沖液懸浮沉淀，得到提純病毒液，取20μL4℃保存，用于電鏡檢測；另取480μL-20℃保存。

1.2.2病毒的電鏡觀察及紫外檢測

提純病毒液經適當稀釋，取1滴滴于Parafilm膜上，取有支持膜的銅網，膜向下置于液滴表面，放置數分鐘，挾起銅網，從銅網邊緣吸去余液，似干未干之時將膜向下置于2%磷鎢酸液（PTA）滴上染色30s至2min，吸干余液，置于JEOLJEM-1200E-X電鏡下觀察病毒粒子形態。以pH值為7.2的0.01mol/LPB緩沖液為參照，用該緩沖液稀釋病毒液再用紫外分光光度計測D260nm、D280nm值，計算病毒濃度、產量[5]。

1.2.3抗血清制備

于試驗前1周到兔場選取體質量約2kg的健康新西蘭大白兔公兔6只，每種病毒用2只，編號分別為W1和W2、Ba1和Ba2、C1和C2，于實驗室飼養觀察1周以度過應激反應期。兔免疫前取耳緣靜脈2mL左右血液作為健康血清。免疫分6次進行，每隔1周注射1次，第1、第2、第3次采取大腿2點及背部皮下多點注射，注射所用病毒劑量為0.5mg；第3次注射結束10d后，取0.5mg病毒分別加強免疫，采用耳緣靜脈注射，連續免疫3次，每次間隔1周。第1次注射用等體積完全佐劑充分乳化，后面5次用等體積不完全佐劑充分乳化。最后1次免疫10d后預采血進行效價測定，達到要求后進行大量采血。取血前1d晚上停止喂食，只少量飲水。采用心臟采血方式，每次取血完后將血漿放入滅菌培養皿中，室溫下放置2h，移入4℃冰箱擺成斜面放置過夜。吸取血清，6000r/min離心10min，棄殘余血球沉淀，上清即為抗血清[6]。

1.2.4抗血清效價測定

第6次免疫后第10天預采血2mL，采用TAS-ELISA法[7]測定抗血清效價。抗血清按1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800、1/25600、1/51200、1/102400、1/204800梯度進行稀釋，同時取注射前的血清（本底血清）按同樣的梯度進行稀釋作為陰性對照，取包被液作為空白對照，試驗組及對照組每個稀釋度均做3個平行。

1.2.5抗血清特異性評價

對3種病毒的抗血清進行特異性評價。經鑒定單獨感染RSV、RBSDV、WYMV、BaYMV、CWMV等5種病毒的病葉用0.05mol/L包被緩沖液（pH值為9.6）稀釋20倍包被ELISA板，分別以3種病毒的免疫原作為陽性對照，健康葉汁為陰性對照，每處理重復3次，采用TAS-ELISA法測定3種抗血清的特異性。

1.2.6TAS-ELISA最適條件確定

采用方陣試驗對3種病毒的抗血清進行TAS-ELISA最適條件測定。酶標板縱向從上而下，用pH值為9.6的碳酸緩沖液從1∶156.25至1∶20000倍比稀釋3種多抗，酶標板橫向從左至右用樣品緩沖液以1∶10～1∶5120倍比稀釋，酶標抗體稀釋倍數為5000倍，分別以3種病毒為陽性對照（病毒稀釋80倍，抗體同上倍比稀釋），健康葉汁為陰性對照（葉片同上倍比稀釋，抗體156.25倍稀釋），每處理設3次重復，P/N>2.1作為陽性判斷標準。基于“1.2.5”節中同屬的WYMV與BaYMV抗血清有輕微的血清學交叉反應，作TAS-ELISA最適條件測定時，僅攜帶WYMV的樣品同上倍比稀釋，用BaYMV抗體同上倍比稀釋進行檢測，陽性及陰性對照設置同上，每處理設3個重復。僅攜帶BaYMV的樣品用WYMV抗體采用同上處理方式進行檢測，以尋找避開2種抗血清交叉反應的檢測樣品及各自抗血清最佳稀釋倍數。

1.2.7抗血清的檢測應用

利用3種病毒抗血清的TAS-ELISA方法對大麥、小麥樣品進行檢測，在江蘇省高郵市、寶應市、儀征市、常州市、泰州市姜堰區、興化市、鹽城市鹽都區、淮安市、大豐市，安徽省壽縣及來安縣，河南省遂平縣，山東省臨沂市、泰安市、濟寧市等地的大麥、小麥中采集3種病毒疑似樣品，用溫室生長的大麥、小麥健康葉片作陰性對照，病圃中經檢測為3種病毒的病葉為陽性對照，每處理設3個重復，以P/N>2.1作為陽性判斷標準。

2結果與分析

2.13種提純病毒的電鏡觀察及濃度檢測

提純的3種病毒經2%磷鎢酸負染后在透射電鏡下觀察（圖1），3種病毒經蔗糖硫酸銫不連續密度梯度離心后均有較純且濃密的病毒粒子，同屬的WYMV、BaYMV可見直線狀或彎線狀病毒粒子，粒子長度達200nm以上，WYMV粒子比BaYMV粒子長；CWMV為直桿狀病毒粒子，粒子長度100～300nm，直徑約為20nm。用紫外分光光度法測得提純病毒濃度分別為5.44mg/mL（WYMV）、8.08mg/mL（BaYMV）、4.09mg/mL（CWMV）。

2.23種病毒抗血清效價的測定

分別獲得2株抗血清，以間接ELISA法測定2株抗血清的效價。由圖2可知，免疫前的本底血清在3種病毒免疫反應中都較弱，制備的3種抗血清分別在稀釋12800倍（WYMV）、25600倍（BaYMV）、6400倍（CWMV）下仍有明顯的血清學反應，表明三者的抗血清效價分別達1∶12800、1∶25600、1∶6400，3種抗血清均可用于后續免疫學試驗。

2.33種病毒抗血清特異性評價

由表1可知，同屬大麥黃花葉病毒屬的WYMV與BaYMV有弱的血清學交叉反應，2種病毒的抗血清與CWMV、RSV、RBSDV反應均較弱。CWMV抗血清特異性較強，除自身病毒外，與其他4種病毒的反應均接近于健康植株的反應。

2.43種抗血清的TAS-ELISA方法建立

方陣試驗結果表明，作包被的3種多抗血清倍比稀釋后進行TAS-ELISA測定，WYMV、BaYMV、CWMV多抗分別在1∶10000、1∶20000、1∶5000稀釋度下，P/N值均大于2.1。3種病毒的樣品稀釋度為1∶10～1∶640時都較理想，當稀釋度為1∶1280時，P/N值小于2.1，可以確定1∶640為檢測極限稀釋度。考慮到實際應用時檢測靈敏度較高，初步確定3種病毒樣品稀釋度都選擇1∶160，多抗稀釋度分別選擇1∶5000（WYMV）、1∶10000（BaYMV）、1∶2500（CWMV）作為TAS-ELISA的最適工作濃度。表2顯示，BaYMV樣品稀釋80倍、WYMV多抗稀釋5000～10000倍時，病樣的吸光度約為健樣的2倍，說明抗體稀釋5000倍是臨界值。表3顯示，當WYMV樣品稀釋160倍時，BaYMV多抗稀釋度為10000倍時是臨界值。由此可知，WYMV、BaYMV樣品適度為160倍，抗體稀釋度分別選擇1∶8000、1∶12000。

2.53種病毒抗血清的檢測應用

應用3種抗血清的TAS-ELISA檢測方法，對采自全國4個省16個縣（市、區）的60個樣品進行檢測。由表4可知，WYMV分布最為廣泛，除了在江蘇省鹽城市的大麥及淮安市、大豐市2地的小麥樣品中均未檢到外，其余縣市均有分布，陽性檢出率在20%以上。CWMV不僅在大豐市、淮安市2個老病區的樣品上檢測到，而且在興化市的樣品中也檢測到，興化市樣品中有1株還存在WYMV與CWMV復合侵染的情況。鹽城市的大麥樣品上均為BaYMV，說明這3種病毒仍是麥類較為流行的病毒。大麥樣品中均未檢測到WYMV，小麥樣品中也未檢出BaYMV，說明應用筆者建立的TAS-ELISA檢測方法可以有效避免2種抗血清的交叉反應。

3結論與討論

WYMV、BaYMV、CWMV都是由禾谷多黏菌傳播的。禾谷多黏菌是1種專性寄生于植物根部的低等真核生物，本身沒有致病性，但是可以傳播多種禾谷類作物病毒，引起禾谷類作物嚴重減產。此類病毒在病葉中的含量很低，較難提純，主要原因是組織搗爛時病毒粒子容

易斷裂，且提純過程中病毒粒子容易聚集、不易懸浮、易丟失等。筆者選用PEG沉淀法，先用CCl4分離植物與病毒蛋白，用聚乙二醇沉淀病毒，懸浮液中加入0.1%巰基乙醇與0.3%TitonX-100，有效地解決病毒易聚集的問題。采用蔗糖硫酸銫不連續密度梯度法提純病毒，克服了蔗糖密度梯度難以成帶的問題，結果表明，采用此法提純病毒時梯度離心后管中出現1條非常明顯的病毒帶，此帶經進一步離心后得到濃度高且較純的病毒，3種提純

病毒紫外檢測均呈典型核蛋白吸收曲線，透射電鏡觀察到類似的病毒粒子，檢測濃度在4.09mg/mL以上。進一步使用3種提純病毒免疫新西蘭大白兔，制備了3種病毒的抗血清。經測定，制備的3種抗血清效價分別達1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特異性較強，同屬的WYMV與BaYMV抗體存在較弱的血清學交叉反應，為了避免檢測中出現假陽性問題，筆者對檢測樣品及抗體進行倍比稀釋方陣試驗，確定了能夠避免交叉反應的稀釋倍數，建立了3種抗體的TAS-ELISA檢測方法，并對田間樣品進行了應用檢測。雖然之前已有這3種病毒相關抗體的報道[8-9]，但是制備抗體的毒源材料有差異，制備抗體的效價也不同。應用筆者建立的3種抗體的TAS-ELISA方法對田間樣品檢測結果顯示，3種病毒在江蘇省均有分布，特別是WYMV在江蘇省7個縣（市）均有分布，帶毒率也較高，說明WYMV對江蘇省小麥的危害仍然存在。

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病毒紫外檢測均呈典型核蛋白吸收曲線，透射電鏡觀察到類似的病毒粒子，檢測濃度在4.09mg/mL以上。進一步使用3種提純病毒免疫新西蘭大白兔，制備了3種病毒的抗血清。經測定，制備的3種抗血清效價分別達1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特異性較強，同屬的WYMV與BaYMV抗體存在較弱的血清學交叉反應，為了避免檢測中出現假陽性問題，筆者對檢測樣品及抗體進行倍比稀釋方陣試驗，確定了能夠避免交叉反應的稀釋倍數，建立了3種抗體的TAS-ELISA檢測方法，并對田間樣品進行了應用檢測。雖然之前已有這3種病毒相關抗體的報道[8-9]，但是制備抗體的毒源材料有差異，制備抗體的效價也不同。應用筆者建立的3種抗體的TAS-ELISA方法對田間樣品檢測結果顯示，3種病毒在江蘇省均有分布，特別是WYMV在江蘇省7個縣（市）均有分布，帶毒率也較高，說明WYMV對江蘇省小麥的危害仍然存在。

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