木薯組織培養外植體選擇和滅菌研究

岑湘濤+沈偉+楊美純+農艷豐+蘇小茴

摘要：以木薯品種華南205為材料，研究外植體類型與不同滅菌方法對其組織培養的影響。試驗結果表明：9—10月份室外取材滅菌效果最理想，HgCl2滅菌處理7—8月份取的外植體的時間需控制在10min內，而滅菌處理9—10月份取的外植體的時間需控制在5min。此外，室內水培木薯莖段和室外莖段的中部均可作為組織培養的良好材料。

關鍵詞：木薯；外植體；組織培養；滅菌

中圖分類號：S533.043文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0071-02

木薯（ManihotesculentaCrantz）別稱樹木薯、樹番薯，大戟科木薯屬，是世界3大薯類作物（馬鈴薯、甘薯、木薯）之一。木薯耐貧瘠、耐干旱、抗性強，單位面積產量高，淀粉產出量高，素有“地下糧倉”、“淀粉之王”和“能源作物”之美譽[1]。目前木薯主要用途是食用、飼用和在工業上的開發利用。其中90%以上的木薯主要用于淀粉和變性淀粉的生產。近年來用木薯作為能源植物生產燃料乙醇，使得國家可再生能源法將木薯列為發展生物質能源的少數幾種植物之一，能源木薯產業顯示出極大的發展潛力[2]。

廣西是我國最大的木薯種植省區，其木薯乙醇產量、變性淀粉、山梨醇等產量均居全國前列，木薯及其產品群總值也位居全國之首[3]。目前生產上木薯多采用成熟的莖段進行營養繁殖，這種方式繁殖率低，導致良種推廣速度慢。利用組織培養技術對木薯進行快速繁殖，將是加速木薯良種大面積推廣的有效途徑[4-6]。在木薯組織培養中，選擇適合的外植體，是其組織培養能否成功的一個關鍵。此外，木薯外植體表面和內部常攜帶一些微生物，是組織培養過程的主要污染源，解決外植體污染是木薯組織培養能否成功的另一個關鍵。因此，在本研究中，針對木薯組織培養中存在的問題，將重點研究外植體類型和滅菌方法對其組織培養效果的影響，以期為木薯組培快繁提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試品種為華南205的室外莖段和水培莖段，室外采樣地點為廣西大學農學院大田。

1.2試驗方法

1.2.1室外莖段取材和滅菌

取樣時間與滅菌過程：分別于5—6月、7—8月、9—10月在田間選取木薯健康植株上帶芽的莖段作為外植體。將莖段從葉柄基部切除葉片，用洗衣粉溶液浸泡10～15min，再用自來水沖洗10～15min，然后將莖段切成帶1～2個芽、長約1.5cm的小段，在超凈工作臺內進行表面滅菌，方法如下：75%乙醇漂洗20s后，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2溶液中，滅菌時間設5、7、10min3個處理。滅菌期間不斷搖動，使外植體與滅菌劑充分接觸。經上述滅菌處理后無菌水沖洗5～6次，接種到MS培養基中。

外植體類型：將帶芽莖段分為3個部分，頂芽以下第1～2個芽為上部；第3～6個芽為中部；第7個芽以下為下部。按照上述方法對外植體進行預處理后，用75%乙醇進行表面滅菌20s，無菌水沖洗1次，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2的溶液中滅菌5min，最后用無菌水沖洗5～6次，接種到MS培養基中。

1.2.2水培莖段取材與滅菌

田間采集的莖段經剪截處理后，將莖段基部浸入清水中5cm左右，2d換水1次，4d修剪枝條基部截面1次，并小心刷凈枝條基部污垢，以防導管堵塞，影響水分吸收。待水培芽長至15cm左右時剪下作為接種外植體。滅菌方法如下：0.1%HgCl2滅菌4、5、6min，然后無菌水沖洗5～6次，之后接種到MS培養基中。培養天后統計污染率和成活率。

1.2.3培養條件

接種后的材料均在25±5℃的培養室中培養，每天以1600～2000lx的光照強度照射約10h。

1.2.4數據統計

以上試驗均于1周內統計結果。污染率=污染株數/接種的外植體總數×100%；成活率=成活數/（外植體總數-污染數-死亡數）×100%。

2結果與分析

2.1取樣和滅菌時間對外植體培養的影響

從表1可知，取樣時間和滅菌時間共同影響外植體培養效果，其中5—6月污染控制難度大，3個滅菌處理控制污染的效果均不理想，污染率最高達到100%；7—8月污染控制較為容易，隨著滅菌時間的增加，污染率從66.7%降到44.1%；9—10月份污染控制效果最理想，污染率最低為35.0%。為將污染率和死亡率控制到最低，不同取樣時期需要不同的HgCl2處理時間，其中7—8月份取樣時HgCl2處理時間需控制在10min內，9—10月份取樣時HgCl2處理時間需控制在5min。

2.2外植體部位對其組織培養效果的影響

從表2可看出，外植體部位對其組織培養效果影響很大，其中靠近頂芽的莖段太幼嫩，雖然污染少，但由于組織太幼嫩，很容易被乙醇和HgCl2損傷，所以接種后大部分莖段褐化死亡，因此不適合作為組織培養的外植體；第7位及以下的芽位莖段中大部分是海綿狀的髓部，很難徹底消毒，所以也不適合作為外植體；而頂芽以下第3～6個芽較幼嫩，成活率相對較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

2.3滅菌時間對水培外植體組織培養效果的影響

由于水培的木薯莖段組織幼嫩，因此不采用乙醇和HgCl2結合的滅菌方法。單獨使用0.1%HgCl2溶液處理時，隨著處理時間的延長，污染率降低，但其成活率也相應降低，當處理時間達到6min時，成活率為70.0%（表3）。綜合比較，0.1%HgCl2處理5min是水培芽最適宜的滅菌方法。

3結論與討論

外植體選擇是影響組培微繁效果的一個非常重要的因素。本試驗結果表明，不同來源的外植體污染率存在很大差異，用水培方法獲得的外植體污染率低、存活率高，而室外莖段由于長時間暴露在田間，菌類孳生，作外植體時，污染率較高。盡管水培莖段培養具有污染率低、存活率高等優點，但水培莖段受時間條件制約，同時水培時間較長時自身儲藏的營養物質被消耗而影響外植體質量。對于組織培養工廠化育苗來說，要求年繁殖數達到百萬株或者更多，用水培莖段做外植體則遠遠不能滿足要求。因此，將2種外植體同時用于實踐，在各個時期相互補充，才能不斷滿足木薯種苗周年生產的要求。在用室外莖段做外植體時，外植體選取的時期、部位對污染的影響都至關重要[7]。應根據取材時間外植體污染控制的難易程度，充分考慮污染因素，調整滅菌方案。植物組織培養中外植體種類的選擇以污染少、易啟動為原則[8-9]。本試驗通過對外植體部位對組織培養效果影響的研究，發現木薯頂芽以下第3～6個芽較幼嫩，成活率相對較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

參考文獻：

[1]甘騫.木薯的種植與利用[J].云南農業科技，1996（5）：28-30.

[2]王建梅.木薯將成發展生物能源的生力軍[J].中國農業信息，2006（12）：12-13.

[3]木薯淀粉酒精網.廣西木薯產業發展引起國內外專家熱議[EB/OL].（2009-03-06）[2014-09-05].http：//www.vnsugar.com.

[4]覃艷，陳宇.木薯組織培養快速繁殖的研究[J].廣西農業科學，2007，38（1）：35-37.

[5]李斌，黃永才，覃劍鋒，等.木薯優良品種“華南124”的組織培養[J].廣西熱帶農業，2008（4）：9-11.

[6]何承光.木薯良種GR891組織培養與快速繁殖技術[J].南方農業學報，2011，42（5）：471-474.

[7]陳正華.木本植物組織培養及其應用[M].北京：高等教育出版社，1986.

[8]曹孜義，劉國民.實用植物組織培養技術教程[M].蘭州：甘肅科學技術出版社，1996.

[9]潘瑞熾.植物組織培養[M].廣州：廣東高等教育出版社，2000.

摘要：以木薯品種華南205為材料，研究外植體類型與不同滅菌方法對其組織培養的影響。試驗結果表明：9—10月份室外取材滅菌效果最理想，HgCl2滅菌處理7—8月份取的外植體的時間需控制在10min內，而滅菌處理9—10月份取的外植體的時間需控制在5min。此外，室內水培木薯莖段和室外莖段的中部均可作為組織培養的良好材料。

關鍵詞：木薯；外植體；組織培養；滅菌

中圖分類號：S533.043文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0071-02

木薯（ManihotesculentaCrantz）別稱樹木薯、樹番薯，大戟科木薯屬，是世界3大薯類作物（馬鈴薯、甘薯、木薯）之一。木薯耐貧瘠、耐干旱、抗性強，單位面積產量高，淀粉產出量高，素有“地下糧倉”、“淀粉之王”和“能源作物”之美譽[1]。目前木薯主要用途是食用、飼用和在工業上的開發利用。其中90%以上的木薯主要用于淀粉和變性淀粉的生產。近年來用木薯作為能源植物生產燃料乙醇，使得國家可再生能源法將木薯列為發展生物質能源的少數幾種植物之一，能源木薯產業顯示出極大的發展潛力[2]。

廣西是我國最大的木薯種植省區，其木薯乙醇產量、變性淀粉、山梨醇等產量均居全國前列，木薯及其產品群總值也位居全國之首[3]。目前生產上木薯多采用成熟的莖段進行營養繁殖，這種方式繁殖率低，導致良種推廣速度慢。利用組織培養技術對木薯進行快速繁殖，將是加速木薯良種大面積推廣的有效途徑[4-6]。在木薯組織培養中，選擇適合的外植體，是其組織培養能否成功的一個關鍵。此外，木薯外植體表面和內部常攜帶一些微生物，是組織培養過程的主要污染源，解決外植體污染是木薯組織培養能否成功的另一個關鍵。因此，在本研究中，針對木薯組織培養中存在的問題，將重點研究外植體類型和滅菌方法對其組織培養效果的影響，以期為木薯組培快繁提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試品種為華南205的室外莖段和水培莖段，室外采樣地點為廣西大學農學院大田。

1.2試驗方法

1.2.1室外莖段取材和滅菌

取樣時間與滅菌過程：分別于5—6月、7—8月、9—10月在田間選取木薯健康植株上帶芽的莖段作為外植體。將莖段從葉柄基部切除葉片，用洗衣粉溶液浸泡10～15min，再用自來水沖洗10～15min，然后將莖段切成帶1～2個芽、長約1.5cm的小段，在超凈工作臺內進行表面滅菌，方法如下：75%乙醇漂洗20s后，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2溶液中，滅菌時間設5、7、10min3個處理。滅菌期間不斷搖動，使外植體與滅菌劑充分接觸。經上述滅菌處理后無菌水沖洗5～6次，接種到MS培養基中。

外植體類型：將帶芽莖段分為3個部分，頂芽以下第1～2個芽為上部；第3～6個芽為中部；第7個芽以下為下部。按照上述方法對外植體進行預處理后，用75%乙醇進行表面滅菌20s，無菌水沖洗1次，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2的溶液中滅菌5min，最后用無菌水沖洗5～6次，接種到MS培養基中。

1.2.2水培莖段取材與滅菌

田間采集的莖段經剪截處理后，將莖段基部浸入清水中5cm左右，2d換水1次，4d修剪枝條基部截面1次，并小心刷凈枝條基部污垢，以防導管堵塞，影響水分吸收。待水培芽長至15cm左右時剪下作為接種外植體。滅菌方法如下：0.1%HgCl2滅菌4、5、6min，然后無菌水沖洗5～6次，之后接種到MS培養基中。培養天后統計污染率和成活率。

1.2.3培養條件

接種后的材料均在25±5℃的培養室中培養，每天以1600～2000lx的光照強度照射約10h。

1.2.4數據統計

以上試驗均于1周內統計結果。污染率=污染株數/接種的外植體總數×100%；成活率=成活數/（外植體總數-污染數-死亡數）×100%。

2結果與分析

2.1取樣和滅菌時間對外植體培養的影響

從表1可知，取樣時間和滅菌時間共同影響外植體培養效果，其中5—6月污染控制難度大，3個滅菌處理控制污染的效果均不理想，污染率最高達到100%；7—8月污染控制較為容易，隨著滅菌時間的增加，污染率從66.7%降到44.1%；9—10月份污染控制效果最理想，污染率最低為35.0%。為將污染率和死亡率控制到最低，不同取樣時期需要不同的HgCl2處理時間，其中7—8月份取樣時HgCl2處理時間需控制在10min內，9—10月份取樣時HgCl2處理時間需控制在5min。

2.2外植體部位對其組織培養效果的影響

從表2可看出，外植體部位對其組織培養效果影響很大，其中靠近頂芽的莖段太幼嫩，雖然污染少，但由于組織太幼嫩，很容易被乙醇和HgCl2損傷，所以接種后大部分莖段褐化死亡，因此不適合作為組織培養的外植體；第7位及以下的芽位莖段中大部分是海綿狀的髓部，很難徹底消毒，所以也不適合作為外植體；而頂芽以下第3～6個芽較幼嫩，成活率相對較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

2.3滅菌時間對水培外植體組織培養效果的影響

由于水培的木薯莖段組織幼嫩，因此不采用乙醇和HgCl2結合的滅菌方法。單獨使用0.1%HgCl2溶液處理時，隨著處理時間的延長，污染率降低，但其成活率也相應降低，當處理時間達到6min時，成活率為70.0%（表3）。綜合比較，0.1%HgCl2處理5min是水培芽最適宜的滅菌方法。

3結論與討論

外植體選擇是影響組培微繁效果的一個非常重要的因素。本試驗結果表明，不同來源的外植體污染率存在很大差異，用水培方法獲得的外植體污染率低、存活率高，而室外莖段由于長時間暴露在田間，菌類孳生，作外植體時，污染率較高。盡管水培莖段培養具有污染率低、存活率高等優點，但水培莖段受時間條件制約，同時水培時間較長時自身儲藏的營養物質被消耗而影響外植體質量。對于組織培養工廠化育苗來說，要求年繁殖數達到百萬株或者更多，用水培莖段做外植體則遠遠不能滿足要求。因此，將2種外植體同時用于實踐，在各個時期相互補充，才能不斷滿足木薯種苗周年生產的要求。在用室外莖段做外植體時，外植體選取的時期、部位對污染的影響都至關重要[7]。應根據取材時間外植體污染控制的難易程度，充分考慮污染因素，調整滅菌方案。植物組織培養中外植體種類的選擇以污染少、易啟動為原則[8-9]。本試驗通過對外植體部位對組織培養效果影響的研究，發現木薯頂芽以下第3～6個芽較幼嫩，成活率相對較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

參考文獻：

[1]甘騫.木薯的種植與利用[J].云南農業科技，1996（5）：28-30.

[2]王建梅.木薯將成發展生物能源的生力軍[J].中國農業信息，2006（12）：12-13.

[3]木薯淀粉酒精網.廣西木薯產業發展引起國內外專家熱議[EB/OL].（2009-03-06）[2014-09-05].http：//www.vnsugar.com.

[4]覃艷，陳宇.木薯組織培養快速繁殖的研究[J].廣西農業科學，2007，38（1）：35-37.

[5]李斌，黃永才，覃劍鋒，等.木薯優良品種“華南124”的組織培養[J].廣西熱帶農業，2008（4）：9-11.

[6]何承光.木薯良種GR891組織培養與快速繁殖技術[J].南方農業學報，2011，42（5）：471-474.

[7]陳正華.木本植物組織培養及其應用[M].北京：高等教育出版社，1986.

[8]曹孜義，劉國民.實用植物組織培養技術教程[M].蘭州：甘肅科學技術出版社，1996.

[9]潘瑞熾.植物組織培養[M].廣州：廣東高等教育出版社，2000.

摘要：以木薯品種華南205為材料，研究外植體類型與不同滅菌方法對其組織培養的影響。試驗結果表明：9—10月份室外取材滅菌效果最理想，HgCl2滅菌處理7—8月份取的外植體的時間需控制在10min內，而滅菌處理9—10月份取的外植體的時間需控制在5min。此外，室內水培木薯莖段和室外莖段的中部均可作為組織培養的良好材料。

關鍵詞：木薯；外植體；組織培養；滅菌

中圖分類號：S533.043文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0071-02

木薯（ManihotesculentaCrantz）別稱樹木薯、樹番薯，大戟科木薯屬，是世界3大薯類作物（馬鈴薯、甘薯、木薯）之一。木薯耐貧瘠、耐干旱、抗性強，單位面積產量高，淀粉產出量高，素有“地下糧倉”、“淀粉之王”和“能源作物”之美譽[1]。目前木薯主要用途是食用、飼用和在工業上的開發利用。其中90%以上的木薯主要用于淀粉和變性淀粉的生產。近年來用木薯作為能源植物生產燃料乙醇，使得國家可再生能源法將木薯列為發展生物質能源的少數幾種植物之一，能源木薯產業顯示出極大的發展潛力[2]。

廣西是我國最大的木薯種植省區，其木薯乙醇產量、變性淀粉、山梨醇等產量均居全國前列，木薯及其產品群總值也位居全國之首[3]。目前生產上木薯多采用成熟的莖段進行營養繁殖，這種方式繁殖率低，導致良種推廣速度慢。利用組織培養技術對木薯進行快速繁殖，將是加速木薯良種大面積推廣的有效途徑[4-6]。在木薯組織培養中，選擇適合的外植體，是其組織培養能否成功的一個關鍵。此外，木薯外植體表面和內部常攜帶一些微生物，是組織培養過程的主要污染源，解決外植體污染是木薯組織培養能否成功的另一個關鍵。因此，在本研究中，針對木薯組織培養中存在的問題，將重點研究外植體類型和滅菌方法對其組織培養效果的影響，以期為木薯組培快繁提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試品種為華南205的室外莖段和水培莖段，室外采樣地點為廣西大學農學院大田。

1.2試驗方法

1.2.1室外莖段取材和滅菌

取樣時間與滅菌過程：分別于5—6月、7—8月、9—10月在田間選取木薯健康植株上帶芽的莖段作為外植體。將莖段從葉柄基部切除葉片，用洗衣粉溶液浸泡10～15min，再用自來水沖洗10～15min，然后將莖段切成帶1～2個芽、長約1.5cm的小段，在超凈工作臺內進行表面滅菌，方法如下：75%乙醇漂洗20s后，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2溶液中，滅菌時間設5、7、10min3個處理。滅菌期間不斷搖動，使外植體與滅菌劑充分接觸。經上述滅菌處理后無菌水沖洗5～6次，接種到MS培養基中。

外植體類型：將帶芽莖段分為3個部分，頂芽以下第1～2個芽為上部；第3～6個芽為中部；第7個芽以下為下部。按照上述方法對外植體進行預處理后，用75%乙醇進行表面滅菌20s，無菌水沖洗1次，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2的溶液中滅菌5min，最后用無菌水沖洗5～6次，接種到MS培養基中。

1.2.2水培莖段取材與滅菌

田間采集的莖段經剪截處理后，將莖段基部浸入清水中5cm左右，2d換水1次，4d修剪枝條基部截面1次，并小心刷凈枝條基部污垢，以防導管堵塞，影響水分吸收。待水培芽長至15cm左右時剪下作為接種外植體。滅菌方法如下：0.1%HgCl2滅菌4、5、6min，然后無菌水沖洗5～6次，之后接種到MS培養基中。培養天后統計污染率和成活率。

1.2.3培養條件

接種后的材料均在25±5℃的培養室中培養，每天以1600～2000lx的光照強度照射約10h。

1.2.4數據統計

以上試驗均于1周內統計結果。污染率=污染株數/接種的外植體總數×100%；成活率=成活數/（外植體總數-污染數-死亡數）×100%。

2結果與分析

2.1取樣和滅菌時間對外植體培養的影響

從表1可知，取樣時間和滅菌時間共同影響外植體培養效果，其中5—6月污染控制難度大，3個滅菌處理控制污染的效果均不理想，污染率最高達到100%；7—8月污染控制較為容易，隨著滅菌時間的增加，污染率從66.7%降到44.1%；9—10月份污染控制效果最理想，污染率最低為35.0%。為將污染率和死亡率控制到最低，不同取樣時期需要不同的HgCl2處理時間，其中7—8月份取樣時HgCl2處理時間需控制在10min內，9—10月份取樣時HgCl2處理時間需控制在5min。

2.2外植體部位對其組織培養效果的影響

從表2可看出，外植體部位對其組織培養效果影響很大，其中靠近頂芽的莖段太幼嫩，雖然污染少，但由于組織太幼嫩，很容易被乙醇和HgCl2損傷，所以接種后大部分莖段褐化死亡，因此不適合作為組織培養的外植體；第7位及以下的芽位莖段中大部分是海綿狀的髓部，很難徹底消毒，所以也不適合作為外植體；而頂芽以下第3～6個芽較幼嫩，成活率相對較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

2.3滅菌時間對水培外植體組織培養效果的影響

由于水培的木薯莖段組織幼嫩，因此不采用乙醇和HgCl2結合的滅菌方法。單獨使用0.1%HgCl2溶液處理時，隨著處理時間的延長，污染率降低，但其成活率也相應降低，當處理時間達到6min時，成活率為70.0%（表3）。綜合比較，0.1%HgCl2處理5min是水培芽最適宜的滅菌方法。

3結論與討論

外植體選擇是影響組培微繁效果的一個非常重要的因素。本試驗結果表明，不同來源的外植體污染率存在很大差異，用水培方法獲得的外植體污染率低、存活率高，而室外莖段由于長時間暴露在田間，菌類孳生，作外植體時，污染率較高。盡管水培莖段培養具有污染率低、存活率高等優點，但水培莖段受時間條件制約，同時水培時間較長時自身儲藏的營養物質被消耗而影響外植體質量。對于組織培養工廠化育苗來說，要求年繁殖數達到百萬株或者更多，用水培莖段做外植體則遠遠不能滿足要求。因此，將2種外植體同時用于實踐，在各個時期相互補充，才能不斷滿足木薯種苗周年生產的要求。在用室外莖段做外植體時，外植體選取的時期、部位對污染的影響都至關重要[7]。應根據取材時間外植體污染控制的難易程度，充分考慮污染因素，調整滅菌方案。植物組織培養中外植體種類的選擇以污染少、易啟動為原則[8-9]。本試驗通過對外植體部位對組織培養效果影響的研究，發現木薯頂芽以下第3～6個芽較幼嫩，成活率相對較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

參考文獻：

[1]甘騫.木薯的種植與利用[J].云南農業科技，1996（5）：28-30.

[2]王建梅.木薯將成發展生物能源的生力軍[J].中國農業信息，2006（12）：12-13.

[3]木薯淀粉酒精網.廣西木薯產業發展引起國內外專家熱議[EB/OL].（2009-03-06）[2014-09-05].http：//www.vnsugar.com.

[4]覃艷，陳宇.木薯組織培養快速繁殖的研究[J].廣西農業科學，2007，38（1）：35-37.

[5]李斌，黃永才，覃劍鋒，等.木薯優良品種“華南124”的組織培養[J].廣西熱帶農業，2008（4）：9-11.

[6]何承光.木薯良種GR891組織培養與快速繁殖技術[J].南方農業學報，2011，42（5）：471-474.

[7]陳正華.木本植物組織培養及其應用[M].北京：高等教育出版社，1986.

[8]曹孜義，劉國民.實用植物組織培養技術教程[M].蘭州：甘肅科學技術出版社，1996.

[9]潘瑞熾.植物組織培養[M].廣州：廣東高等教育出版社，2000.