10種金發蘚科植物RAPD分子系統學研究

鄭艷冰+叢永柱+吳瓊+沙偉

摘要：利用改良CTAB法提取10種金發蘚科（Polytrichales）植物基因組DNA，利用RAPD和分子標記技術對其進行遺傳多樣性研究。結果表明，在供試材料中篩選到具有多態性的RAPD引物12個，這些RAPD引物共擴增出68條帶，多態性帶42條，多態性條帶比率（PPB）為61.76%；采用UPGMA聚類分析，供試材料分為2大類群，細葉擬金發蘚單獨聚為1類，其余9種植物聚為1類。RAPD和分子標記技術可用于金發蘚科植物系統學研究。

關鍵詞：金發蘚科；RAPD；系統學；遺傳多樣性

中圖分類號：Q75文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0058-03

金發蘚科（Polytrichales）為金發蘚目中唯一的1個科，全世界共有19個屬，其中，Eopolytrichum為1個化石屬[1]。Schofield保守估計認為金發蘚目大約有370種[2]，但新近判斷認為，該目實際上的種數不超過200種[3]。對金發蘚科一些屬種的分類地位，不同學者有不同的認識[4-8]。吳鵬程等將穗發蘚屬的主要種類及擬仙鶴蘚屬和新金發蘚屬歸并入小金發蘚屬；將金發蘚屬中孢蒴口部蓋膜呈肉質的種劃入擬金發蘚屬[9]。Zouhair等利用隨機擴增引物對金發蘚屬6種植物進行RAPD分析，共獲得166條多態性DNA片段，根據RAPD分子標記結果，將6種植物分為2大類群，即金發蘚、擬金發蘚和P.c.var.perigoniale為1類，檜葉金發蘚、毛尖金發[LL]蘚和P.strictum為1類，第1大類中金發蘚與擬大金發蘚之間的親緣關系更近一些[10]。金發蘚科的許多植物在經典分類學上分類地位不清，且一些分子標記的試驗結果與經典分類學結論相悖，這為金發蘚科系統學研究提供了更廣闊的空間。本研究采用RAPD分析方法，對金發蘚科10種蘚類植物進行遺傳聚類分析，以期為更好地研究蘚類植物的分類地位奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為自然風干的標本及2012年采集的新鮮標本，材料種名、采集地等信息見表1。

1.2儀器及藥品

1.2.1儀器美國產PE-9600型PCR儀；北京六一儀器廠產DY-3型電泳儀和DYCP-33A型水平板電泳槽；日本產7A0-0012型GeneSpecl、SANYO制冰機和NUALR-6382E型超低溫冰箱；河北省黃驊航天儀器廠產DZKW-D型水浴鍋；德國產高速冷凍離心機HERMLEZ323K；1mL和20、200、100μL微量加樣器；UVPGDS-8000型紫外凝膠成像系統；Barnstead純水儀；PHS-25型酸度計；北京賽多利斯天平有限公司產電子天平。

1.2.2藥品Tris、HCl、EDTA、NaOH、溴化乙錠（EB）、乙酸鈉、冰乙酸、TE、CTAB、NaCl、TBE、乙醇、氯仿、異戊醇、溴酚藍、蔗糖、抗壞血酸鈉、PVP和3%β-巰基乙醇等，均為分析純（AR）；4種dNTP、TaqDNA聚合酶及A、B、C、D、H、Y組引物，均為上海生工生物工程股份有限公司產品；DGL2000Marker，為大連寶生物公司產品。

1.3試驗方法

1.3.1DNA提純、保存及檢測采用改良CTAB法提取試材DNA；放入-20℃冰箱儲存或放入4℃冰箱待用；利用核酸檢測儀通過紫外吸收法對DNA樣品進行定量分析和純度檢測，并用瓊脂糖電泳檢測DNA。

1.3.2RAPD擴增

1.3.2.1擴增反應體系RAPD擴增體系總體積為25μL，其中，10×buffer、25mmol/LMg2+、10mmol/LeachdNTP、25g/LTemplateDNA、5000U/mLTaqpolymerase和10mmol/LPrimer等組分體積分別為2.5、2.0、1.0、1.0、0.3、0.8μL，用無菌ddH2O補足。

1.3.2.2擴增反應程序94℃2min；94℃1min，36℃1min，72℃2min，43個循環；72℃5min，1個循環。

1.3.2.3RAPD反應體系的優化RAPD反應體系為25μL，擴增引物為A11。針對反應體系中模板DNA、dNTP、引物和Taq酶濃度等4個組分，L16（54）正交試驗基礎上進一步進行L9（43）正交設計（表2、表3），以尋求最優方案。

1.3.4擴增產物的檢測擴增結束，在反應混合物中加入5mL/L上樣緩沖液，混勻；取15μL點入1.5%瓊脂糖凝膠中，用0.5×TBE電泳緩沖液在3V/cm（84V）電場下電泳2～3h，經0.25mg/L溴化乙錠染色30min，在紫外凝膠成像系統下觀察照相和分析。

1.3.5引物篩選正式擴增前，任意選取系統進化差異較大的2個不同品種DNA，以這2個品種均能擴增出清晰條帶、重復性和多態性好的為引物選擇依據，對上海生工生產的A、B、C、D、H、Y組共6組隨機引物進行篩選。

1.3.6數據處理在篩選出的引物中，選取擴增清晰、穩定、重復性好的引物進行條帶統計。電泳獲得基因組擴增圖譜的每1條帶（DNA片段）均為1個分子標記，并代表引物的1個結合位點；根據各分子標記在相同電泳遷移率的有無，統計得到所有位點的二元矩陣，有DNA擴增帶（顯性）記為“1”，無帶記為“0”，強帶或可分辨的弱帶賦值均為“1”；用NTSYS-PC軟件處理RAPD數據，依據NEI-LI法計算各品種間的遺傳相似度，按照類平均法（UPGMA）建立親緣關系樹狀圖。

2結果與分析

2.1RAPD反應體系優化

在L9（43）正交試驗設計中，組合1、3擴增出2條帶，組合2擴增出4條帶，組合5擴增出1條帶，其余組合未擴增出條帶；組合2的多態性及清晰度最好，最佳RAPD擴增反應條件為反應總體積25μL、dNTP為0.4mmol/L、引物為0.4mmol/L、基因組DNA為15ng、Taq酶2.0U，其他成分為無菌ddH2O。

2.2引物篩選

利用優化反應體系對上海生工生物工程股份有限公司生產的A、B、C、D、H、Y組120條引物進行篩選，共篩選出12條多態性好的引物（表4），用于全部供試樣品DNA的擴增。

2.3擴增結果

選用重復性和多態性較好、譜帶清晰的12條引物對4屬10種金發蘚科植物樣品進行RAPD擴增，結果由圖1、圖2、圖3和表5可見，每個引物的擴增片段在2～9條之間；12個隨機引物共獲得68條譜帶，即共檢測到68個位點，平均每個引物檢測到5.67個位點，其中，多態性條帶為42條，多態百分率為61.76%。

2.4聚類分析

基于RAPD擴增結果，用UPGAM法進行聚類分析，得到供試材料相似性系數表和10種金發蘚科植物系統學關系樹狀圖。由表6和圖4可見，10種金發蘚科植物的遺傳相似性系數在0.02～0.96之間，說明這10種植物親緣關系較近；細葉擬金發蘚與其他種遺傳距離較遠，自為1類，其余9種聚為1類；其他9種植物的遺傳相似性系數在0.64處又可分2兩類，即硬葉小金發蘚和細疣小金發蘚聚為1類，其余7種聚為

1類；這7種植物在遺傳相似性系數0.78處又可聚為2類，即小仙鶴蘚和小胞仙鶴蘚聚為1類，臺灣擬金發蘚、擬金發蘚、多形擬金發蘚、毛尖金發蘚和檜葉金發蘚聚為1類。這說明10種金發蘚科植物遺傳相似性極高，與形態解剖學及其形態分類學地位表現出高度的一致性，這也與

參考文獻：

[1]KonopkaAS，HerendeenPS，MerrillGL，etal.Sporophytesandgametophytesofpolytrichaceaefromthecampanian（latecretaceous）ofGeorgia，USA[J].InternationalJournalofPlantSciences，1997，158（4）：489-499.

[2]BuckWR.Introductiontobryology[J].Brittonia，1986，38（1）：94-95.

[3]HyvnenJ，HeddersonTA，MerrillGL，etal.Onphylogenyofthepolytrichales[J].TheBryologist，1998，101（4）：489-504.

[4]SmithGL.ConspectusofthegeneraofPolytrichaceae[M].NewYork：MemoirsoftheNewYorkBotanicalGarden，1971.

[5]AbolinAA.Polytrichumstrichum（Polytrichaceae）—anorginalspeciesofmordificantP.junipericum[J].BotZum，1983，70（10）：1503-1511.

[6]SchrieblA.CultureexperimentsonthemossgenusPolytrichum[J].JournalofHattoriBotanicalLaboratory，1982，53（2）：157-158.

[7]SmithMGL.NotesonasiaticPolytrichaceaeⅠ，Ⅱ[J].MemoirsoftheNewYork：BotanicalGarden，1987，45：419-425.

[8]SmithMGL.NotesonNorthAmericanPolytrichaceae：Polytrichastrum[J].TheBryologist，1992，95（3）：270-273.

[9]吳鵬程，賈渝.中國苔蘚志：第八卷[M].北京：科學出版社，2004.

[10]ZouhairR，CorradiniP，DefontaineA，etal.RAPDmarkersforgeneticdifferentiationofspecieswithinPolytrichum（Polytrichaceae，Musci）：apreliminarysurvey[J].Taxon，2000，49（2）：217-229.

[11]HyvnenJ，KoskinenS，MerrillGL，etal.Phylogenyofthepolytrichales（bryophyta）basedonsimultaneousanalysisofmolecularandmorphologicaldata[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2004，31（3）：915-928.

2.2引物篩選

利用優化反應體系對上海生工生物工程股份有限公司生產的A、B、C、D、H、Y組120條引物進行篩選，共篩選出12條多態性好的引物（表4），用于全部供試樣品DNA的擴增。

2.3擴增結果

選用重復性和多態性較好、譜帶清晰的12條引物對4屬10種金發蘚科植物樣品進行RAPD擴增，結果由圖1、圖2、圖3和表5可見，每個引物的擴增片段在2～9條之間；12個隨機引物共獲得68條譜帶，即共檢測到68個位點，平均每個引物檢測到5.67個位點，其中，多態性條帶為42條，多態百分率為61.76%。

2.4聚類分析

基于RAPD擴增結果，用UPGAM法進行聚類分析，得到供試材料相似性系數表和10種金發蘚科植物系統學關系樹狀圖。由表6和圖4可見，10種金發蘚科植物的遺傳相似性系數在0.02～0.96之間，說明這10種植物親緣關系較近；細葉擬金發蘚與其他種遺傳距離較遠，自為1類，其余9種聚為1類；其他9種植物的遺傳相似性系數在0.64處又可分2兩類，即硬葉小金發蘚和細疣小金發蘚聚為1類，其余7種聚為

1類；這7種植物在遺傳相似性系數0.78處又可聚為2類，即小仙鶴蘚和小胞仙鶴蘚聚為1類，臺灣擬金發蘚、擬金發蘚、多形擬金發蘚、毛尖金發蘚和檜葉金發蘚聚為1類。這說明10種金發蘚科植物遺傳相似性極高，與形態解剖學及其形態分類學地位表現出高度的一致性，這也與

參考文獻：

[1]KonopkaAS，HerendeenPS，MerrillGL，etal.Sporophytesandgametophytesofpolytrichaceaefromthecampanian（latecretaceous）ofGeorgia，USA[J].InternationalJournalofPlantSciences，1997，158（4）：489-499.

[2]BuckWR.Introductiontobryology[J].Brittonia，1986，38（1）：94-95.

[3]HyvnenJ，HeddersonTA，MerrillGL，etal.Onphylogenyofthepolytrichales[J].TheBryologist，1998，101（4）：489-504.

[4]SmithGL.ConspectusofthegeneraofPolytrichaceae[M].NewYork：MemoirsoftheNewYorkBotanicalGarden，1971.

[5]AbolinAA.Polytrichumstrichum（Polytrichaceae）—anorginalspeciesofmordificantP.junipericum[J].BotZum，1983，70（10）：1503-1511.

[6]SchrieblA.CultureexperimentsonthemossgenusPolytrichum[J].JournalofHattoriBotanicalLaboratory，1982，53（2）：157-158.

[7]SmithMGL.NotesonasiaticPolytrichaceaeⅠ，Ⅱ[J].MemoirsoftheNewYork：BotanicalGarden，1987，45：419-425.

[8]SmithMGL.NotesonNorthAmericanPolytrichaceae：Polytrichastrum[J].TheBryologist，1992，95（3）：270-273.

[9]吳鵬程，賈渝.中國苔蘚志：第八卷[M].北京：科學出版社，2004.

[10]ZouhairR，CorradiniP，DefontaineA，etal.RAPDmarkersforgeneticdifferentiationofspecieswithinPolytrichum（Polytrichaceae，Musci）：apreliminarysurvey[J].Taxon，2000，49（2）：217-229.

[11]HyvnenJ，KoskinenS，MerrillGL，etal.Phylogenyofthepolytrichales（bryophyta）basedonsimultaneousanalysisofmolecularandmorphologicaldata[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2004，31（3）：915-928.

2.2引物篩選

利用優化反應體系對上海生工生物工程股份有限公司生產的A、B、C、D、H、Y組120條引物進行篩選，共篩選出12條多態性好的引物（表4），用于全部供試樣品DNA的擴增。

2.3擴增結果

選用重復性和多態性較好、譜帶清晰的12條引物對4屬10種金發蘚科植物樣品進行RAPD擴增，結果由圖1、圖2、圖3和表5可見，每個引物的擴增片段在2～9條之間；12個隨機引物共獲得68條譜帶，即共檢測到68個位點，平均每個引物檢測到5.67個位點，其中，多態性條帶為42條，多態百分率為61.76%。

2.4聚類分析

基于RAPD擴增結果，用UPGAM法進行聚類分析，得到供試材料相似性系數表和10種金發蘚科植物系統學關系樹狀圖。由表6和圖4可見，10種金發蘚科植物的遺傳相似性系數在0.02～0.96之間，說明這10種植物親緣關系較近；細葉擬金發蘚與其他種遺傳距離較遠，自為1類，其余9種聚為1類；其他9種植物的遺傳相似性系數在0.64處又可分2兩類，即硬葉小金發蘚和細疣小金發蘚聚為1類，其余7種聚為

1類；這7種植物在遺傳相似性系數0.78處又可聚為2類，即小仙鶴蘚和小胞仙鶴蘚聚為1類，臺灣擬金發蘚、擬金發蘚、多形擬金發蘚、毛尖金發蘚和檜葉金發蘚聚為1類。這說明10種金發蘚科植物遺傳相似性極高，與形態解剖學及其形態分類學地位表現出高度的一致性，這也與

參考文獻：

[1]KonopkaAS，HerendeenPS，MerrillGL，etal.Sporophytesandgametophytesofpolytrichaceaefromthecampanian（latecretaceous）ofGeorgia，USA[J].InternationalJournalofPlantSciences，1997，158（4）：489-499.

[2]BuckWR.Introductiontobryology[J].Brittonia，1986，38（1）：94-95.

[3]HyvnenJ，HeddersonTA，MerrillGL，etal.Onphylogenyofthepolytrichales[J].TheBryologist，1998，101（4）：489-504.

[4]SmithGL.ConspectusofthegeneraofPolytrichaceae[M].NewYork：MemoirsoftheNewYorkBotanicalGarden，1971.

[5]AbolinAA.Polytrichumstrichum（Polytrichaceae）—anorginalspeciesofmordificantP.junipericum[J].BotZum，1983，70（10）：1503-1511.

[6]SchrieblA.CultureexperimentsonthemossgenusPolytrichum[J].JournalofHattoriBotanicalLaboratory，1982，53（2）：157-158.

[7]SmithMGL.NotesonasiaticPolytrichaceaeⅠ，Ⅱ[J].MemoirsoftheNewYork：BotanicalGarden，1987，45：419-425.

[8]SmithMGL.NotesonNorthAmericanPolytrichaceae：Polytrichastrum[J].TheBryologist，1992，95（3）：270-273.

[9]吳鵬程，賈渝.中國苔蘚志：第八卷[M].北京：科學出版社，2004.

[10]ZouhairR，CorradiniP，DefontaineA，etal.RAPDmarkersforgeneticdifferentiationofspecieswithinPolytrichum（Polytrichaceae，Musci）：apreliminarysurvey[J].Taxon，2000，49（2）：217-229.

[11]HyvnenJ，KoskinenS，MerrillGL，etal.Phylogenyofthepolytrichales（bryophyta）basedonsimultaneousanalysisofmolecularandmorphologicaldata[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2004，31（3）：915-928.