玉米C4型PEPC全長基因的克隆與表達載體構建

王雷+崔震海+張立軍

摘要：以玉米自交系鄭58基因組DNA為模板，設計了2對特異性引物，分別PCR擴增玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）啟動子及其全長編碼序列，利用In-Fusion技術將兩者定向克隆到載體pCAMBIA-1391Z上，并對重組子進行測序驗證。結果表明，該PEPC啟動子序列與GenBank中的玉米自交系B73的同源性為97.70%，片段長1200bp；全長編碼序列同源性為97.90%，片段長6330bp。通過HindⅢ和EcoRⅠ酶切載體pCAMBIA-1391Z，利用In-Fusion技術將線性載體與之前獲得的2個PCR片段連接，測序結果與預期序列一致，表明成功構建了pCAMBIA-1391Z-PEPC植物表達載體。對克隆和載體構建中存在的問題進行了討論，以期為該類型基因的高效克隆及表達載體的構建提供參考、為C4型PEPC基因功能研究和C3植物遺傳轉化提供可用的基因序列。

關鍵詞：玉米；PEPC；基因克隆；序列分析；表達載體構建

中圖分類號：Q786；S513.01文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0026-04

根據CO2固定初始產物的不同，可將高等植物分成C3、C4、CAM這3類。以三碳化合物3-磷酸甘油酸為最初光合產物的光合途徑為C3途徑（或卡爾文循環），以四碳化合物草酰乙酸為最初光合產物的光合途徑為C4途徑。C4途徑具有CO2濃縮機制，能高效利用大氣中的CO2，使植物保持較高的光合效率[1-3]，因此人們大量開展了將C3植物轉化為C4植物的研究，但是許多這類轉化沒有達到預期目的[4]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）存在于所有能進行光合作用的有機體中，包括植物、綠藻和光合細菌等。根據其序列特征和功能結構，PEPC基因可劃分為C4、C3-1、C3-23個亞族，其中C4型主要在葉肉細胞的胞質中表達，并且受光照調控，C3-1型主要在黃色葉片、莖等部位表達，C3-2型主要在根部表達；C4型的PEPC基因由C3型PEPC基因進化而來[5-7]。研究表明，將雜交玉米品種（GoldenCrossBantam）的C4型PEPC全長基因（包括自身的啟動子）轉入C3植物，PEPC酶活性提高了2～110倍，蘋果酸濃度也提高了，光合速率在強光條件下明顯提高。研究還發現，轉玉米PEPC基因cDNA和水稻Cab啟動子的嵌合基因的水稻僅能使光合作用效率提高數倍，而將完整的玉米PEPC基因（包括外顯子、內含子及自身的啟動子）轉入水稻中則能數十倍或更高地提高其光合效率[8-17]。這說明以嵌合基因形式轉化C3植物，即cDNA和組成型啟動子CaMV35S或光誘導型Cab啟動子，或采用C4全長基因和自身啟動子進行轉化，對基因更好地表達和作用的發揮是十分必要的。

另外，C4關鍵酶基因由于序列較長，即使成功克隆，也不容易連入表達載體。在傳統載體構建方法中，需要將基因的2個末端經過酶切修飾后插入載體，不僅要尋找合適的酶切位點，而且操作復雜，通常還需要構建多個中間載體，并進行多次酶切連接轉化，工作量較大而且構建效率較低，尤其不適合構建長片段、多片段拼接的復雜載體。In-Fusion是近年來發展起來的高效率載體構建技術，已應用于多基因融合和長片段克隆等方面[18]，運用該技術進行基因克隆和載體構建時，不需要借助T4DNA連接酶和補平DNA片段末端等操作步驟，只是在PCR引物設計中分別引入載體酶切位點兩端的各15bp序列，在In-Fusion重組酶作用下將PCR產物和已經線性化的載體連接起來，從而完成載體構建。In-Fusion技術對目的片段和載體沒有特殊的要求，可以將任何目的基因連接到線性化載體上。

玉米的C4型PEPC基因序列較長，同時還需要連入啟動子，多片段連接表達載體存在困難。因此，本研究利用PCR技術擴增玉米C4型PEPC全長編碼序列及其啟動子序列，結合In-Fusion技術一步成功構建表達載體，并對克隆和載體構建中存在的問題進行討論，以期為該類型基因的高效克隆及表達載體的構建提供參考，進而為C4型PEPC基因功能的研究和C3植物的遺傳轉化提供可用的基因序列。

1材料與方法

1.1植物材料、菌株和載體

玉米（ZeamaysL.）自交系鄭58、pCAMBIA-1391Z植物表達載體（圖1）由筆者所在實驗室保存，E.coliHST08Premium菌株購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2主要試劑

PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）試劑盒、TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0試劑盒（CodeNo.9762）、In-FusionHDCloningKit試劑盒、高效感受態細菌制備試劑盒E.coliCompetentCellsHST08Premium（CodeNo.9128）、各種限制性內切酶、DNAmarker均購自寶生物工程（大連）有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）、質粒提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3引物設計

根據In-Fusion技術原理，利用NCBI上已經發表的玉米C4光合關鍵酶PEPC基因全長DNA序列（GenBank號：CM000785.3）和表達載體pCAMBIA-1391Z，設計并合成PEPC基因啟動子及其全長編碼序列的引物，詳見表1。

1.4玉米C4型PEPC啟動子及其全長編碼序列的PCR擴增

采用以上引物和PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）試劑盒，以玉米自交系鄭58基因組DNA為模板，對PEPC基因啟動子進行PCR擴增，50μLPCR總反應體系為：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（Mg2+plus），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR擴增程序為：98℃變性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min，共進行30個循環。同樣，對PEPC基因全長編碼序列進行PCR擴增，50μLPCR總反應體系為：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（含Mg2+），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR擴增程序為：98℃變性10s，60℃退火15s，68℃延伸6min，共進行30個循環。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收用于后續試驗。同時取PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.5植物表達載體的構建

分別用HindⅢ、RcoRⅠ雙酶切植物表達載體pCAMBIA-1391Z。50μL酶切反應體系為：5μLpCAMBIA-1391Z，5μL10×Mbuffer，1.5μLHindⅢ（10U/μL），1.5μLEcoRⅠ（10U/μL），37μLddH2O，37℃完全酶切16h。用瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收目的片段，利用In-FusionHDCloningKit（ClontechCodeNo.639633）試劑盒將“1.4”節中經過測序驗證正確并回收的PEPC基因全長編碼序列、PEPC基因啟動子片段和線性載體pCAMBIA-1391Z片段連接，連接反應體系為：1μLPEPC基因擴增回收片段（約80ng/μL），1μLPEPC基因啟動子擴增回收片段（約80ng/μL），1μLpCAMBIA-1391Z酶切片段，2μL5×In-FusionHDEnzymePremix，5μLddH2O。取1μL連接產物，熱轉化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，涂布平板，37℃過夜培養，挑取陽性克隆、提質粒、測序驗證，所得載體命名為pCAMBIA-1391Z-PEPC。

2結果與分析

2.1玉米基因組DNA的提取

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取的玉米基因組DNA，由圖2的0.8%瓊脂糖凝膠電泳與紫外檢測結果看出，D260nm/D280nm在1.8～2.0之間，表明模板質量較高，符合后續試驗要求。

2.2玉米C4型PEPC啟動子及其全長編碼序列的克隆

2.2.1目的片段的獲得以玉米自交系鄭58葉片DNA為模板，通過PCR分別擴增出2條大小約為1200bp（圖3）、6330bp的特異性條帶（圖4），利用瓊脂糖回收試劑盒（DP209）進行膠回收并測序。

2.2.2PCR產物測序結果的比對通過BLAST將測序結果與玉米B73相關序列進行比對，PEPC啟動子PCR擴增產物與玉米B73PEPC啟動子的比對結果見圖5，經分析相似度達到97.70%；PEPC基因全長編碼序列PCR擴增產物與玉米B73PEPC基因的比對結果見圖6，經分析相似度達到97.90%。

由以上結果可以看出，試驗用的玉米自交系鄭58C4型PEPC基因及其啟動子序列與已注冊的玉米B73的序列相似度都在90%以上，可以用作后續載體構建。

2.2.3PEPC基因植物表達載體的構建采用In-Fusion克隆技術，將載體pCAMBIA-1391Z經HindⅢ/RcoRⅠ雙酶切，獲得的片段檢測結果見圖7，可見片段大小為11000bp。線性化載體pCAMBIA-1391Z、PEPC基因全長及其啟動子在In-FusionHDEnzymePremix作用下重組，成功獲得重組質粒pCAMBIA-1391Z-PEPC。將重組質粒熱轉化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，挑陽性克隆測序，結果表明，PEPC基因全長及其啟動子已經成功插入到載體pCAMBIA-1391Z之中，測序結果與預期結果一致（圖8），表明成功構建了植物表達載體pCAMBIA-1391Z-PEPC。

3討論與結論

植物表達載體的構建在植物基因工程研究中占據重要地位，直接關系到目的基因的表達效果，因此選擇方便與快捷的載體構建方法具有重要的意義。目前，人們已經發明了多種表達載體構建的方法，例如傳統酶切連接方法、一步克隆法、Gateway技術等[19-20]。在構建表達載體過程中，首先需要對表達載體進行選擇，常用的植物表達載體有pBI121、pBI221、pCAMBIA系列載體（載體的骨架是pUC18）。根據本試驗克隆的PEPC基因全長編碼序列及其啟動子，筆者選擇了沒有

啟動子序列的植物表達載體pCAMBIA-1391Z。多個目的片段插入植物表達載體常常受到酶切位點的限制，操作復雜，費時費力。與傳統的載體構建方法相比，In-Fusion技術可以減少中間載體的構建，減少連接、轉化次數，重組效率高；相對于Gateway技術來說，In-Fusion技術更簡單，更快速。本研究采用In-Fusion技術進行目的片段克隆時，引物5′端設計與線性載體同源的15bp序列，通過PCR實現多目的片段與表達載體重組連接。試驗中分別用HindⅢ/EcoRⅠ進行雙酶切，利用In-Fusion酶將線性載體與之前獲得的2個PCR片段連接，成功構建pCAMBIA-1391Z-PEPC植物表達載體，測序結果與預期序列一致。

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