應(yīng)用酶催化動力學

　　市場上銷售的祛斑美白類化妝品絕大多數(shù)都是通過抑制酪氨酸酶的活性而起作用的，因此，檢測其對酪氨酸酶活性的抑制強度是評價其功效的模式之一。
　　吸光光度法具有快速、靈敏和準確等特點，已成為檢測酶催化反應(yīng)動力學的首選方法。由于化妝品的一些特性（成分復(fù)雜、多為乳化型、無公認的標準品等），應(yīng)用吸光光度法檢測美白化妝品的實驗中曾遇到一些問題，就將幾個主要問題的解決方法簡介如下。
　　
　　一、 乳化型樣品的預(yù)處理
　　
　　消費者使用的是由生產(chǎn)廠家將多種原材料復(fù)配后的最終產(chǎn)品即市售的化妝品（成品），而不是某種添加劑，所以，檢測美白的功效應(yīng)測定化妝品（成品）。
　　然而，大多數(shù)美白類化妝品都是乳化型的，此種劑型不能直接應(yīng)用于光度法檢測，必須預(yù)先做相應(yīng)處理。
　　1．測相型
　　檢測乳化型化妝品的相型，如果是O/H型可以與水溶性添加劑和非乳化型化妝品一樣直接進行下一步操作。如果是H/O型，則采用轉(zhuǎn)型操作法使其轉(zhuǎn)成O/H型。
　　2． 溶解、稀釋
　　稱取定量（W）樣品放入定量（V）去離子水或三蒸水（應(yīng)無銅離子）中，充分攪拌使之完全溶解。
　　3． 沉淀
　　 經(jīng)沉淀等處理后可獲得能用于光度法檢測的澄清液，其透光度可達到100%（極少數(shù)接近100%）并保持添加劑的原有活性。
　　
　　二、 實驗對照的設(shè)置
　　
　　1．陰性和（或）空白對照 遵照實驗室工作常規(guī)設(shè)置以溶劑（去離子水，PB）和含有不同溶質(zhì)（酪氨酸酶，多巴）的溶液為陰性對照，以鑒別誤差和用于計算分析。
　　2． 陽性對照 本對照管內(nèi)含有全部反應(yīng)物（酶及酶催化底物）而無酶活性抑制物，所以，與其它管比較，其酶活力最強，反應(yīng)速度最快、反應(yīng)產(chǎn)物最多。
　　本對照至關(guān)重要，可作為判定下述內(nèi)容的依據(jù)。
　　1） 判定檢測體系（試劑、儀器、操作）是否準確。
　　2） 判定參考標準對照是否正確。
　　3） 判定被檢樣品有無干擾。
　　
　　3． 參考標準對照
　　實驗操作應(yīng)有標準品對照，在尚無公認的祛斑美白類化妝品標準品之前我們選用已知的種類和濃度的添加劑曲酸（kojic Acid）作為參考標準對照。曲酸的美白作用機理清楚、量效相關(guān)性好，抑制強度適中等特性適宜做對照品。
　　檢測時以2%的曲酸作為標準濃度，根據(jù)需要實測時再做不同濃度的稀釋。
　　
　　三、 判定指標的采集及應(yīng)用
　　
　　1． 實驗條件（溫度、PH值和離子強度等）固定情況下，酶催化反應(yīng)過程中酶的活性具體表現(xiàn)為一條時間與反應(yīng)產(chǎn)物（生成物）產(chǎn)量相關(guān)的動力曲線，即酶的活力越強，反應(yīng)速度越快，（完成反應(yīng)的時間越短），反應(yīng)產(chǎn)物的量越多。我們可以在這條線上任一個點采集時間和產(chǎn)量的相關(guān)數(shù)據(jù)。如：在反應(yīng)后達到一定的OD值（0.3、0.5和1.0）的時間；達到最終反應(yīng)的時間；不同時間（5min、10 min、20 min ... ...）的OD值；反應(yīng)終止時的OD值。
　　2． 將陽性對照不同濃度的參考標準對照與樣品的上述結(jié)果進行比較即可判斷出樣品抑制酪氨酸酶活性的強弱程度。具體方法可選用：
　　1） 抑制率比較法
　　以陽性對照為對照，計算出參考標準對照和被測樣品的抑制率。
　　根據(jù)參考標準對照的結(jié)果調(diào)配酶的用量，使2%曲酸（SIGMA501-30-4）的抑制率盡量接近50%，將實測結(jié)果定為100%，再將樣品實測結(jié)果也乘以相同倍數(shù)得到調(diào)整后的抑制率為最終結(jié)果。
　　如能保持實驗條件的穩(wěn)定性，可以不做參考標準對照，直接讀取樣品的抑制率。
　　2） 圖（表）比較法
　　將2%曲酸和被測樣品作同倍稀釋后，再將曲酸溶液作3次高倍稀釋。將4份不同濃度的曲酸溶液進行檢測，將前述所得判定指標繪成坐標圖（時間為橫坐標，OD值為縱坐標），再以相同條件檢測樣品，將所得結(jié)果也填在圖上。由于其所處區(qū)域的不同，可一目了然地判定出對酪氨酸酶活性的抑制強度。也可將所得結(jié)果列表進行比較。
　　3）樣品抑制酪氨酸酶活性強度的表述可用文字或數(shù)字表述。)
　　樣抑制酪氨酸酶活性的強度分為：
　　強＞較強＞較弱 ＞弱；
　　好＞較好＞差；
　　90%以上＞80%以上＞70%以上＞60%以上＞59%以下；
　　80%以上＞60%以上＞59%以下
　　
　　四、 干擾現(xiàn)象的鑒別
　　
　　實驗發(fā)現(xiàn)有的添加劑的抑制酪氨酸酶活性的程度在復(fù)配后可有所增減，這種現(xiàn)象稱為"干擾"，增強時稱為激動干擾，減弱的稱為抑制干擾。檢測時必須加以鑒別，我們采用同時檢測添加劑，含不同濃度添加劑的化妝品和陽性對照，對比其結(jié)果即可判明有無干擾及其類型。
　　判定出干擾的有無及其類型有實用價值，首先有助準確判定被檢樣品對酪氨酸酶活性抑制的真實強度；其次，有助篩選出能產(chǎn)生激動干擾（如能增強功效的話）的配方和生產(chǎn)出相應(yīng)的產(chǎn)品，這是生產(chǎn)者和使用者共同希望的。
　　編輯/胡迎春