某院產ESBLs大腸埃希菌多位點序列分型研究

潘軍，許青霞，肖偉強，常彥敏，沈勇

(鄭州大學附屬腫瘤醫院檢驗科，河南鄭州450008)

某院產ESBLs大腸埃希菌多位點序列分型研究

潘軍，許青霞，肖偉強，常彥敏，沈勇

(鄭州大學附屬腫瘤醫院檢驗科，河南鄭州450008)

目的了解鄭州大學附屬腫瘤醫院臨床和環境中產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌多位點序列分型(MLST)及其遺傳進化關系，為監測產ESBLs菌株的流行和醫院感染控制提供依據。方法采用基因擴增和測序的方法對26株產ESBLs大腸埃希菌7個管家基因進行序列分析，并與MLST數據庫比對，得到每個菌株相應的等位基因號。結果26株產ESBLs大腸埃希菌獲得16種序列分型(ST)，其中3株為ST69型、3株為ST131型。結論產ESBLs大腸埃希菌遺傳背景多樣化，ST131型和ST69型為本研究主要型別，其它型別散在分布。

超廣譜β-內酰胺酶;大腸埃希菌;多位點序列分型

大腸埃希菌是腸道內大量存在的正常菌群，但當機體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時，可作為條件致病菌引起腸道外感染。近年來，由于大量使用抗菌藥物以及耐藥質粒相互傳遞，造成耐藥菌株明顯增加，引起醫院內感染呈上升趨勢。

多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是近年來發展很快的分子生物學分析方法［1-4］，具有很高的分辨能力，以7個管家基因為基礎，具有相對變化緩慢的突變積累效應，結果以序列分型(sequence type，ST)表示，不同的菌株對應不同的ST，從而可對菌株的等位基因進行多樣性比較。MLST既適于分子流行病學研究，也可用于分子進化學研究。因此我們對分離到的26株產超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase，ESBLs)大腸埃希菌進行MLST研究。

材料和方法

一、菌株來源

收集各種臨床和環境樣本中分離的產ESBLs大腸埃希菌26株。采用法國生物梅里埃公司的全自動微生物鑒定系統VITEK 2及配套的革蘭陰性菌GN卡進行鑒定。經分離鑒定確定為大腸埃希菌，菌株于甘油保存管中-20℃保存備用。質控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)，來自中國菌種保存中心。

二、試劑與儀器

細菌基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、100 bp DNA標準帶(100～2 000 bp) (上海生工生物工程有限公司)、試驗所用引物(上海生工生物工程有限公司)、Premix Taq酶(大連寶生物工程有限公司)、GeneAmp9700聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(美國Applied Biosystems公司)、Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)、Alpha凝膠成像系統(美國ProteinSimple公司)、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)、ABI 3730測序儀(上海生工生物工程有限公司)。

三、ESBLs的表型確認試驗

根據美國臨床實驗室標準化協會(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的推薦方法:血瓊脂培養基復蘇冰凍保存菌株，挑取單個菌落于無菌生理鹽水中調至0.5麥氏單位，涂抹在水解酪蛋白胨平板上，待干后貼加頭孢他啶(30 μg)/頭孢他啶-克拉維酸(30/10 μg)和頭孢噻肟(30 μg)/頭孢噻肟-克拉維酸(30/10 μg)2組藥物敏感性紙片，其中任何一組抑菌圈直徑增大≥5 mm時，則判為產ESBLs菌株。質控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)。

四、DNA模板提取

從35℃過夜培養的血瓊脂培養基中挑取單個菌落4～8個，然后按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA，-20℃保存。

五、MLST

選擇大腸埃希菌的7個管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)作為目的基因進行PCR擴增，引物序列參考文獻［5］合成，見表1。PCR擴增條件:95℃預變性2 min;然后95℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環，最后72℃延伸5 min。PCR擴增產物經試劑盒純化后，由上海生工生物工程有限公司用ABI 3730測序儀進行雙向測序，將測序結果拼接后提交網站(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/ Ecoli)進行比對分析，得到相應的ST，數據庫中不能完全比對的，確認為新的ST。新的等位基因序列、ST和菌株資料均遞交至網站(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/documents/submission_htm l)。

六、數據分析

采用網絡軟件“http://pubmlst.org/ analysis/”對MLST數據進行分析，構建Splits Tree進化關系樹。

表1 7個管家基因引物序列及退火溫度［1］

結果

一、體外藥物敏感性試驗

26株產ESBLs大腸埃希菌中17株來源于引流液、血液、中段尿、膿液和痰液等臨床樣本，9株來自環境或正常部位包括患者手、陪護手、床把手、床頭柜、門和大便。26株產ESBLs大腸埃希菌對亞胺培南、美羅培南的敏感率為100%，未出現耐藥株;對阿莫西林-克拉維酸的敏感率僅為28%，對頭孢類抗菌藥物的耐藥率為100%，對氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率為70%左右，對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、呋喃妥因的敏感率較高，對所有β-內酰胺類抗菌藥物均耐藥。

二、7個管家基因PCR擴增

將26株產ESBLs大腸埃希菌的7個管家基因分別進行PCR擴增，得到7個管家基因預期片段長度583～932 bp。MLST 7個管家基因PCR擴增產物電泳圖見圖1。

三、MLST

對26株產ESBLs大腸埃希菌7個管家基因分別進行擴增，將PCR擴增產物純化后進行測序分析，測序結果提交網站與對應基因的等位基因譜(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA)比對得到每個菌株等位基因號，獲得16種不同的ST，其中ST405型2株、ST2179型2株、ST167型2株、ST10型2株、ST69型3株、ST38型2株、ST2003型2株、ST131型3株，其余為不同的ST，其中17株來自臨床感染病例產ESBLs大腸埃希菌，9株來自環境或正常部位產ESBLs大腸埃希菌。MLST結果見表2、表3。對26株產ESBLs大腸埃希菌MLST的結果采用SplitsTree軟件進行無根系統進化樹分析，結果顯示ST呈現散在分布。依據SplitsTree進化關系圖所示，ST38型和ST2003型屬于同一分支，ST167型和ST10型屬于同一分支，具有較近的親緣關系。見圖2。

圖1 MLST 7個管家基因PCR擴增產物電泳圖

表2 17株臨床感染病例產ESBLs大腸埃希菌MLST結果

表3 9株環境或正常部位產ESBLs大腸埃希菌MLST結果

圖2 大腸埃希菌MLST SplitsTree進化關系圖

討論

MLST是一個具有高分辨率的分子生物學方法［1-4］，克服了脈沖場凝膠電泳分型的不足。由于大腸埃希菌的基因具有高度一致性，管家基因的進化非常慢，多態性位點較少。由于其中任何一個管家基因都有許多等位基因，菌株間有相同等位基因譜的可能性極小。通過網絡對不同地區分離的菌株進行等位基因比較，由此得到的結果在世界各地實驗室之間具有可比性，可以追蹤菌株間的遺傳關系和進化過程，進行群體進化研究和分子流行病學研究。

本研究MLST結果顯示，26株產ESBLs大腸埃希菌共分為16種不同的ST，其中ST405型2株、ST2179型2株、ST167型2株、ST10型2株、ST69型3株、ST38型2株、ST2003型2株、ST131型3株，其余為不同的ST。ST為散在分布，其中ST38(4-26-2-25-5-5-19)和ST2003(4-26-2-25-4-5-19)僅管家基因mdh不同，ST167(10-11-4-8-8-13-2)和ST10(10-11-4-8-8-8-2)僅管家基因purA有差別，用SplitsTree軟件分析ST167和ST10均屬于克隆復合體CC10，提示來源于不同科室的菌株其遺傳背景呈多樣化。潘偉光等［6］對廣東地區27株產ESBLs大腸埃希菌進行了MLST分析，發現8種不同的ST，ST38型4株和ST131型4株相對集中，其余型別為散在分布。本研究結果與上述文獻報道結果相符。ZHANG等［7］對中國西部地區20家醫院分離的144株大腸埃希菌進行研究，發現8株產CTX-M-15酶，其中ST131型3株，另外5株是新的ST型別(ST3342、ST3513、ST3516、ST3517和ST3518)。欲進一步了解河南地區產ESBLs大腸埃希菌的流行情況，還需增加醫院和菌株數量進行深入分析研究，但短期內無法再收集到符合條件的菌株，實驗例數無法增加，這是本研究的不足之處。

多重耐藥大腸埃希菌最主要的流行克隆株是ST131克隆株，目前已有多篇文獻報道過ST131克隆株在全世界范圍內流行。這種克隆株的特征是產CTX-M-15酶，屬于B2進化亞群，大多數菌株表現為血清型O25b:H4，MLST為ST131，即產CTX-M-15型O25b:H4-B2-ST131克隆株［8-10］。此種克隆株攜帶高致病性腸外毒素，容易引起尿路感染、菌血癥和新生兒血流感染［11］。而ST405、ST648、ST10、ST38已成為其他最常見的ST。據報道在南美已經有大腸埃希菌ST131和ST405引起社區發生的感染［12］。ST405克隆株已參與傳播基因編碼CTX-M酶、AmpC β-內酰胺酶、碳青霉烯酶或甲基化酶(AmrA，RmtB)［13-14］。最近的研究報道ST69和ST405在產ESBLs和非產ESBLs之間某一特定的位置發生變異［15］。另有報道稱ST648已經從人類或家禽中產CTX-M型ESBLs大腸埃希菌中分離到［16-18］。本研究中也有這些型別的菌株，說明在中國中部地區也可能存在此種流行克隆株。

本研究16種不同的ST中相對集中的是3株ST131，來源于胸二病區床頭柜和門以及患者痰液樣本，很可能由于患者感染的產ESBLs大腸埃希菌污染周圍環境，在住院患者陪護人員手、病房門把手、床把手及床頭柜均分離出產ESBLs大腸埃希菌，且ST相同屬于同一克隆株。這些因素均可造成產ESBLs大腸埃希菌在患者與患者之間傳播，導致醫院感染的發生。提示ST131可能是該病區流行的克隆菌株，需要進一步研究分析確認是否為ST131型克隆株的傳播。另外，本研究醫院環境中也檢測到ST167、ST410、ST2003、ST10、ST131 5種型別，呈散在分布。

藥物敏感性資料顯示，26株產ESBLs大腸埃希菌對亞胺培南、美羅培南敏感性較高，未出現耐碳青霉烯酶的大腸埃希菌。對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、呋喃妥因耐藥率較低。對氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率較高，對所有β-內酰胺類抗菌藥物均耐藥，應引起臨床高度重視。

產ESBLs大腸埃希菌是醫院感染的常見耐藥菌之一，可長期潛伏在醫院環境中，通過各種途徑在各科室之間相互傳播，隨時引起醫院感染，造成耐藥菌株院內流行。因此，應加強醫院感染易感因素控制及耐藥監測，重視病房消毒隔離工作和加強醫護人員管理，切斷各種感染途徑，有效預防和控制醫院感染的發生。

［1］彭乃杰，林哈妮，夏菲，等.碳青霉稀類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制和多位點序列分型研究［J］.檢驗醫學，2013，28(9):862-863.

［2］王艷海，段寶生，巴特爾，等.鄂爾多斯地區蒙古族人群耐甲氧西林金黃色葡萄球菌基因分型［J］.檢驗醫學，2014，29(2):110-114.

［3］倪語星.關注分子技術在臨床微生物檢驗中的應用［J］.檢驗醫學，2014，29(6):581-583.

［4］姚冬婷，應春妹，鄭冰.微衛星多態性和多位點序列分析技術在光滑念珠菌基因分型中的應用評估［J］.檢驗醫學，2014，29(6):593-596.

［5］TARTOF SY，SOLBERG OD，MANGES AR，et al.Analysis of a uropathogenicEscherichia coliclonal group by multilocus sequence typing［J］.J Clin Microbiol，2005，43(12):5860-5864.

［6］潘偉光，李一凡，鐘海萍，等.產超廣譜β內酰胺酶大腸埃希菌多位點序列分型研究［J］.中國感染與化療雜志，2013，13(4):302-306.

［7］ZHANG L，Lü X，ZONG Z.The emergence of blaCTX-M-15-carrying Escherichia coli of ST131 and new sequence types in Western China［J］.Ann Clin Microbiol Antimicrob，2013，12:35.

［8］BLANCO M，ALONSO MP，NICOLAS-CHANOINE MH，et al.Molecular epidemiology of Escherichia coli producing extended-spectrum beta-lactamases in Lugo (Spain):dissemination of clone O25b:H4-ST131 producing CTX-M-15［J］.J Antimicrob Chemother，2009，63(6):1135-1141.

［9］BLANCO J，MORA A，MAMANI R，et al.Four main virotypes among extended-spectrum-β-lactamaseproducing isolates ofEscherichia coliO25b:H4-B2-ST131:bacterial，epidemiological，and clinical characteristics［J］.J Clin Microbiol，2013，51(10): 3358-3367.

［10］NICOLAS-CHANOINE MH，BLANCO J，LEFLONGUIBOUT V，et al.Intercontinental emergence ofEscherichia coliclone O25:H4-ST131 producing CTXM-15［J］.J Antimicrob Chemother，2008，61(2): 273-281.

［11］ROGERS BA，SIDJABAT HE，PATERSON DL.Escherichia coliO25b-ST131:a pandemic，multiresistant，community-associated strain［J］.J Antimicrob Chemother，2011，66(1):1-14.

［12］RUIZ SJ，MONTEALEGRE MC，RUIZ-GARBAJOSA P，et al.First characterization of CTX-M-15-producingEscherichia coliST131 and ST405 clones causing community-onset infections in south America［J］.J Clin Microbiol，2011，49(5):1993-1996.

［13］NASEER U，HALDORSEN B，TOFTELAND S，et al.Molecular characterization of CTX-M-15-producing clinical isolates ofEscherichia colireveals the spread of multidrug-resistant ST131(O25:H4)and ST964 (O102:H6)strains in Norway［J］.APMIS，2009，117(7):526-536.

［14］TIAN GB，RIVERA JI，PARK YS，et al.Sequence type ST405Escherichia coliisolate producing QepA1，CTX-M-15，and RmtB from Detroit，Michigan［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55(8):3966-3967.

［15］NOVAIS ?，VUOTTO C，PIRES J，et al.Diversity and biofilm-production ability among isolates ofEscherichia coliphylogroup D belonging to ST69，ST393 and ST405 clonal groups［J］.BMC Microbiol，2013，13:144.

［16］SIDJABAT HE，PATERSON DL，ADAMS-HADUCH JM，et al.Molecular epidemiology of CTX-M-producingEscherichia coliisolates at a tertiary medical center in western Pennsylvania［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(11):4733-4739.

［17］CORTéS P，BLANC V，MORA A，et al.Isolation and characterization of potentially pathogenic antimicrobial-resistantEscherichia colistrains from chicken and pig farms in Spain［J］.App l Environ Microbiol，2010，76(9):2799-2805.

［18］EWERS C，BETHE A，STAMM I，et al.CTX-M-15-D-ST648Escherichia colifrom companion animals and horses:another pandemic clone combining multiresistance and extraintestinal virulence［J］.J Antimicrob Chemother，2014，69(5):1224-1230.

M ultilocus sequence typing study of ESBLs-producing Escherichia coli in one hospital

PAN Jun，XU Qingxia，XIAO Weiqiang，CHANG Yanmin，SHEN Yong.(Department of Clinical Laboratory，the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Henan Zhengzhou 450008，China)

ObjectiveTo investigate the multilocus sequence typing(MLST)and genetic evolution of extendedspectrum beta-lactamase(ESBLs)-producingEscherichia coliin the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，and to provide the reference for the monitoring of ESBLs-producing isolates＇epidemic and hospital infection control.MethodsGene amplification and sequence analysis were performed for 7 housekeeping genes of 26 isolates of ESBLsproducingEscherichia coli，and alleles were compared with those assigned at MLST databases.ResultsA total of 16 sequence types(ST)were obtained in the 26 isolates of ESBLs-producingEscherichia coli，in which there were 3 ST69 and 3 ST131.ConclusionsESBLs-producing Escherichia coli has diversified genetic backgrounds，and ST131 and ST69 are the most prevalent types，while other types were scattered.

Extended-spectrum beta-lactamase;Escherichia coli;Multilocus sequence typing

1673-8640(2015)09-0939-05

R378.2

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.017

2014-10-08)

(本文編輯:姜敏)

河南省科技廳重點科技攻關項目(112102310256)

潘軍，女，1983年生，碩士，主管技師，主要從事臨床微生物與細菌耐藥機制研究。

許青霞，聯系電話:0371-65587147。