PL-11血小板分析儀檢測血小板計數及聚集功能的性能評價

蔡玉嬋，趙旭鴻，韓平，陳昌明，李智

(同濟大學附屬楊浦醫院檢驗科，上海200090)

PL-11血小板分析儀檢測血小板計數及聚集功能的性能評價

蔡玉嬋，趙旭鴻，韓平，陳昌明，李智

(同濟大學附屬楊浦醫院檢驗科，上海200090)

目的探討PL-11血小板分析儀在檢測血小板數量及聚集功能方面的性能。方法按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)制定的儀器性能驗證標準及我國衛生行業標準WS/T 406-2012《臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求》對PL-11血小板分析儀進行血小板計數及聚集功能的性能評價。采用PL-11血小板分析儀、LBY-NJ4血小板聚集儀及TEG-5000血栓彈力圖儀檢測健康人群血小板聚集率，分析各儀器檢測結果間的相關性。結果PL-11血小板分析儀的批內及日間精密度均＜1/3總誤差(7%);攜帶污染率為0.32%;在(4.12～1 380.4)×109/L線性范圍內回歸方程斜率為1.03，R2=0.993;血小板計數結果與血小板參考方法的結果符合率為84%，均符合行業標準要求。分別采用PL-11血小板分析儀、LBY-NJ4血小板聚集儀及TEG-5000血栓彈力圖儀檢測79例2型糖尿病患者單服用氯匹格雷前、后血小板聚集率，3種儀器之間差異均無統計學意義(P＞0.05)，患者服藥前、后血小板聚集率差異有統計學意義(P＜0.01)。結論PL-11血小板分析儀可為臨床提供準確、可靠的血小板計數及聚集功能的檢測結果。

血小板聚集;血小板分析儀;連續血小板計數;性能評價

血栓病在人口老年化和多發病譜改變下越來越得到臨床重視。隨著抗血小板藥物的廣泛使用，如何科學的進行個體化治療和療效評價成為一個熱門話題。血栓形成的關鍵和首要因素是血小板［1］，其聚集功能是血小板的一項重要功能，在血栓形成、動脈粥樣硬化中起重要作用，也是目前臨床實踐中對血小板功能活化程度判斷的金標準。但目前血小板聚集功能尚無金標準檢測方法。PL-11血小板分析儀采用全血連續檢測法對血小板計數并檢測血小板聚集功能，這一檢測原理被認為是最有希望普及應用的新方法。為此，我們對該儀器在血小板計數和聚集功能方面的性能進行了評估。

材料和方法

一、研究對象

選取2014年1至11月同濟大學附屬楊浦醫院79例2型糖尿病患者，所有病例均符合1997年美國糖尿病學會(American Diabetes Association，ADA)糖尿病診斷標準，其中服用阿司匹林者40例，男23例，女17例，年齡40～80歲;服用氯匹格雷者39例，男21例，女18例，年齡40～78歲。所有患者均排除可能導致凝血功能異?；蛴绊懧绕ジ窭状x的疾病，入院前均未服用過抗血小板聚集類藥物，入院后單服用阿司匹林100 mg/d［對應的誘聚劑為花生四烯酸(arachidonic acid，AA)］或單服用氯匹格雷75 mg/d［對應的誘聚劑為二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)］，分別在入院時及服藥后10 d檢測血小板聚集率。血小板計數用的高、低值血小板樣本采集自志愿者，共9名，男5名，女4名，年齡55～80歲，均來自同濟大學附屬楊浦醫院血液科。

二、主要儀器和試劑

PL-11血小板分析儀(南京神州英諾華醫療科技有限公司)及配套專用清洗液、血小板稀釋液、質控品。EPICS XL型流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司)及配套試劑。Z2顆粒計數儀(美國Beckman-Coulter公司)。LBY-NJ4血小板聚集儀(北京普利生儀器有限公司)及配套試劑。TEG-5000血栓彈力圖儀(美國Haemoscope公司)。10～100 μL及100～1 000 μL微量移液器為芬蘭LabsyStems公司產品。乙二胺四乙酸二鉀(ethylene diamine tetraacetic acid-K2，EDTA-K2)抗凝真空采血管和檸檬酸鈉抗凝真空采血管為山東威海醫療器械公司產品。PLR-06血小板誘聚劑ADP及PLR-07血小板誘聚劑AA為南京神州英諾華醫療科技有限公司產品。

三、主要性能評估方法

PL-TI血小板分析儀性能評估方法按美國臨床實驗室標準化協會(the Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)制定儀器性能驗證標準及我國衛生行業標準WS/T 406-2012《臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求》進行。

1.批內精密度按CLSI EP5-A文件［2］要求，取EDTA-K2靜脈抗凝血樣本，高、中、低值各1份，重復檢測20次，分別得出血小板計數的變異系數(CV)。

2.日間精密度取高、中、低定值全血質控物值各1份，每天重復測定2次，取均值()，共測定20 d，得出血小板計數的CV。

3.攜帶污染率按照CLSI EP10-A文件［3］要求，取EDTA-K2靜脈抗凝血，高值和低值樣本各1份。高值標本先連續重復測定3次，得到H1、H2、H3;隨后測定低值標本，得L1、L2、L3。攜帶污染率(%)=(L1-L3)/(H3-L3)×100%，其中L1、L3及H3、L3兩者相減所得的差取其絕對值。

4.線性范圍根據EP6-A文件［4］，將一高值EDTA-K2靜脈抗凝血用血細胞分析稀釋液稀釋至不同濃度水平(100%、80%、60%、40%、20%、10%、5%)，計算線性回歸方程及相關系數(R2)。

5.血小板計數準確性選用20份EDTA-K2靜脈抗凝血樣本，以血小板參考方法(流式細胞術)計數血小板的值為定值，然后在PL-11血小板分析儀上進行單次檢測，計算每份樣本檢測結果與定值的相對偏差，以總誤差為評價指標，用相對偏差表示。相對偏差符合PLT≤20%的比例應≥80%。

四、血小板參考方法

按中華人民共和國衛生行業標準WS/T 244-2005《血小板計數參考方法》，將EDTA-K2抗凝血標本用無菌緩沖液進行預稀釋，再用特定的熒光抗體(CD41和CD61)對血小板進行染色。用流式細胞術檢測血小板和紅細胞，根據熒光強度和散射光強度將閾值設在可從紅細胞中區分血小板的位置，以檢測出紅細胞和血小板的比值。用紅細胞的計數值除以紅細胞/血小板的比值計算出血小板計數值。

五、紅細胞計數參考方法

按中華人民共和國衛生行業標準WS/T 245-2005《紅細胞和白細胞計數的參考方法》，用單通道阻抗原理的半自動細胞計數儀(Z2顆粒計數儀)計數紅細胞。將EDTA-K2抗凝血標本用儀器專用稀釋液預稀釋4 000倍，以Z2顆粒計數儀進行計數并得到紅細胞計數。

六、PL-11血小板分析儀檢測血小板聚集率

取500 μL枸櫞酸鈉抗凝血樣本置于儀器待測位，儀器對全血中血小板原始數量檢測后，加入誘聚劑(終濃度為4 mmol/L)后繼續對血小板數量進行連續計數檢測，通過對比未加誘聚劑前血液中血小板數量與加入誘聚劑后血小板數量的變化及血小板下降的速度，評價血小板聚集率。血小板最大聚集率(max aggregation ratio，MAR) (%)=(原始血小板數-聚集后血小板數)/原始血小板數×100;聚集的血小板數量=(原始血小板數-聚集后血小板數)。

七、LBY-NJ4血小板聚集儀檢測血小板聚集率

取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血標本2 mL，先經800×g離心1 min得到富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)，取出500 μL加至比色杯，再次1 500×g離心10 min得到乏血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，取500 μL加至比色杯，采用LBY-NJ4血小板聚集儀檢測。以PPP為空白對照，加誘聚劑(1 mmol/L ADP)5 μL至PRP中(ADP終濃度為10 μmol/L)，其透光度改變最大時得到MAR。

八、TEG檢測血小板聚集率

取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血標本3 mL，用PL-11血小板分析儀和TEG分別測定AA和ADP誘導的血小板聚集率。

九.統計學方法

結果

一、批內與日間精密度

PL-11血小板分析儀計數血小板的精密度較高(CV＜7%)，測得結果滿足WS/T 406-2012中規定的1/3總誤差(CV＜7%)。見表1。

表1 PL-11血小板分析儀計數血小板的批內及日間精密度結果

二、攜帶污染率

按WS/T 406-2012中規定，檢測攜帶污染率時應滿足血小板高值＞900×109/L，低值＜30× 109/L。PL-11血小板分析儀計數血小板的攜帶污染率實際測定值為0.32%，遠遠低于WS/T 406-2012中規定的4%。見表2。

三、線性范圍

按WS/T 406-2012規定，線性回歸方程斜率應在1.00±0.05范圍內，R2≥0.95。血小板的線性范圍為(4.12～1 380.4)×109/L時，回歸方程為Y=1.031 8X+9.565 8，R2=0.993，符合要求。見圖1。

表2 PL-11血小板分析儀計數血小板的攜帶污染率結果

圖1 線性范圍

四、血小板計數的準確性

按WS/T 406-2012規定，血小板計數相對偏差≤20%的比例應≥80%。PL-11血小板分析儀計數血小板值與參考方法相比，相對偏差≤20%的比例為≥84%，符合規定要求。見表3。

五、血小板聚集率檢測

對未服用過抗血小板聚集類藥物的2型糖尿病患者給予單獨氯匹格雷治療后，分別用PL-11血小板分析儀、LBY-NJ4血小板聚集儀(光比濁法)及TEG-5000血栓彈力圖儀檢測用藥前、后的血小板聚集率。結果顯示3種儀器之間差異均無統計學意義(P＞0.05)，但患者用藥前、后血小板聚集率差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表4。

表3 PL-11血小板分析儀計數血小板的準確性

表4 3種儀器檢測2型糖尿病患者單服氯匹格雷前、后的血小板聚集率(%)

討論

血液內的血小板及凝血因子的共同作用可導致血栓的形成。常規凝血因子的檢測已廣泛應用于臨床，血細胞分析只能檢測血小板數量而不能評價血小板功能。目前，對血小板功能的檢測方法尚不成熟。血栓病危害預防不當的原因之一是臨床無法對高危人群及患者的血小板功能進行合理評價，對抗血小板藥物治療療效也無法得到合理評價。測定血小板功能，尤其是聚集功能，對血栓性疾病的發病機制、臨床診斷和輔助診斷、抗血栓治療方案的選擇、監測抗血小板藥物濃度及療效等研究均具有重要意義［5-6］。因此，建立并完善一種操作簡便、準確、快捷的血小板功能評價的新方法仍是研究的熱點之一。

PL-11血小板分析儀采用基于庫爾特原理的連續自動技術，以“全血連續計數法”原理來動態監測血小板數量變化。該儀器對血小板聚集率的檢測是基于血小板計數檢測的基礎上得出的，所以血小板計數的精密度和準確性對該儀器來說是十分重要的指標。本研究對PL-11血小板分析儀的精密度、攜帶污染率及線性范圍均進行了評估，結果完全符合WS/T 406-2012的規定。精密度評估實驗表明PL-11血小板分析儀測定血小板的批內精密度良好，除低值血小板CV＜7%外，其余CV均＜5%。日間精密度顯示連續開機20 d性能穩定，除低值血小板CV＜6%外，其余CV均＜5%。攜帶污染率低僅為0.32%，遠低于規定要求。血小板濃度在(4.12～1 380.4)×109/L范圍內線性良好，實測值與理論值密切相關(R2= 0.993)。該儀器計數血小板的準確性是準確檢測血小板聚集率的基礎，故本研究將該儀器檢測的血小板計數值與參考方法進行比對。結果顯示在高值血小板樣本和中值血小板樣本中，2種方法計數結果的相對偏差均在要求范圍內(≤20%)，而相對偏差≥20%的樣本均為血小板低值樣本，精密度與準確性的結果均表明PL-11血小板分析儀雖已完全滿足WS/T 406-2012中規定的要求，但在計數低值血小板樣本方面還可以進一步改進。

在血小板聚集率的檢測方面，光比濁法被認為是國內檢測血小板聚集率的“金標準”，血栓彈力圖也是近年比較權威的檢測方法。本研究對未服用過抗血小板聚集類藥物的2型糖尿病患者給予單獨服用氯匹格雷治療后，分別采用PL-11血小板分析儀、光比濁法及血栓彈力圖檢測患者服藥前、后的血小板聚集率。結果顯示PL-11血小板分析儀、光比濁法及血栓彈力圖在檢測血小板聚集率方面有較好的對比性，其結果差異無統計學意義(P＞0.05)。但用藥前和用藥后的血小板聚集率差異明顯(P＜0.05)，說明氯匹格雷具有較好的抗血小板聚集功能。但在觀察過程中也發現個別患者的血小板聚集功能在用藥前后變化并不是很大，其可能原因與以下因素有關，如遺傳變異性、患者依從性、用藥劑量不足、CYP3A4相關藥物間的相互作用等。有研究發現，突變的基因型CYP2C19*2和CYP2C19*3可能與氯匹格雷的低反應性臨床表現有關［7-8］。由于本研究的樣本數少，檢測條件有限，且血小板在體外不穩定，致血小板體外活化的因素諸多，故仍需進一步深入研究。

抗血小板藥物治療被廣泛應用于糖尿?。?］及心血管疾?。?0］。評價和提高患者服藥效果更依賴于準確、有效地監測抗血小板藥物的療效。只有操作簡便、快速，檢測結果穩定、可靠的分析儀器才能滿足臨床實際工作的需要。

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Perform ance evaluation of PL-11 p latelet analyzer in the detection of p latelet count and p latelet aggregation

CAI Yuchan，ZHAO Xuhong，HAN Ping，CHEN Changming，LI Zhi.(Department of Clinical Laboratory，Yangpu Hospital，Tongji University，Shanghai 200090，China)

ObjectiveTo investigate the performance of PL-11 platelet analyzer in the detection of platelet count and platelet aggregation.MethodsAccording to the instrument performance verification standards in the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)and the Health Industry Standard of the People＇s Republic of China，WS/T 406-2012:the Quality Standard of Routine Tests in Clinical Hematology，the performance of PL-11 platelet analyzer in the detection of platelet count and platelet aggregation were evaluated.Platelet aggregation rate in healthy subjects was compared for correlation，which was detected by PL-11 platelet analyzer，LBY-NJ4 platelet tester and TEG-5000 thromboelastogram.ResultsThe within-run and inter-day precisions of PL-11 platelet analyzer were＜1/3 of total error (7%)，and the carry-over rate was 0.32%.In(4.12-1 380.4)×109/L linear range，the regression equation slope was 1.03(R2=0.993).The coincidence rate for platelet count by PL-11 platelet analyzer with reference method was 84%.There was no statistical significance of platelet aggregation rate among PL-11 platelet analyzer，LBY-NJ4 platelet tester and TEG-5000 thromboelastogram in 79 patients with type 2 diabetes mellitus(P＞0.05).However，there was statistical significance in platelet aggregation rates before and after taking clopidogrel hydrogen(P＜0.01).ConclusionsPL-11 platelet analyzer can provide accurate and reliable results for platelet count and aggregation.

Platelet aggregation;Platelet analyzer;Continuous platelet count;Performance evaluation

1673-8640(2015)09-0926-05

R446.62

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.014

2014-12-25)

(本文編輯:范基農)

蔡玉嬋，女，1983年生，碩士，主管技師，主要研究方向為抗血栓性疾病治療的機制。

李智，聯系電話:021-65690520。