不同處理方法對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單核細(xì)胞-血小板聚集體的影響

李琳蕓，梅冰，王昌富

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北荊州434020)

不同處理方法對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單核細(xì)胞-血小板聚集體的影響

李琳蕓，梅冰，王昌富

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北荊州434020)

目的探討實(shí)際工作中不同處理方法對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞-血小板聚集體(MPA)的影響，為準(zhǔn)確檢測MPA提供依據(jù)。方法獲取枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈全血，分別以CD14-藻紅蛋白(PE)、CD61-異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記單核細(xì)胞、血小板，以CD62P-PE標(biāo)記活化血小板，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD14-PE/CD61-FITC雙陽性MPA占單核細(xì)胞百分比及血小板CD62P陽性率。采用不同處理方法［全血標(biāo)本處理前后放置不同時(shí)間、全血固定后立即標(biāo)記抗體或放置不同時(shí)間后標(biāo)記抗體、抗體標(biāo)記前全血離心處理、不同抗體組合(抗CD14-PE和抗CD61-FITC，抗CD14-PE和抗CD41-ECD，抗CD45-ECD和抗CD61-FITC)］檢測MPA，比較各種處理方法檢測的MPA是否有差異。結(jié)果與獲取標(biāo)本后立即處理比較，放置于室溫(18～25℃)和低溫(2～8℃)，MPA百分比、血小板CD62P陽性率均隨放置時(shí)間的延長而增加(P＜0.05)，兩者呈正相關(guān)(室溫r=0.82，P＜0.05;低溫r=0.83，P＜0.05)。標(biāo)本處理后立即檢測或低溫保存放置至24 h再檢測，MPA百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與固定前標(biāo)記抗體的處理方法比較，1%多聚甲醛低溫固定全血標(biāo)本后標(biāo)記抗體，或者低溫保存放置至24 h再標(biāo)記抗體，MPA百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。全血標(biāo)本離心處理后，MPA百分率和血小板CD62P陽性率均明顯增加(P＜0.05)。不同的抗體組合檢測MPA百分比的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。結(jié)論獲取全血標(biāo)本后應(yīng)盡快處理，不能立即處理的應(yīng)使用固定劑固定后可低溫保存24 h。在標(biāo)記新鮮全血標(biāo)本前，應(yīng)避免離心，處理完畢的標(biāo)本使用固定劑固定后可低溫保存24 h再用流式細(xì)胞術(shù)檢測。不同抗體組合應(yīng)驗(yàn)證后使用，CD14/CD61、CD14/CD41、CD45/CD61組合均適用于檢測MPA。

單核細(xì)胞-血小板聚集體;流式細(xì)胞術(shù);處理方法

在多種疾病中，包括外周血管疾病、高血壓、冠狀動(dòng)脈綜合癥、糖尿病等，循環(huán)中的血小板活化均可增加。這些血小板能結(jié)合各種類型的白細(xì)胞，其中最受關(guān)注的是單核細(xì)胞［1］。多種分子相互結(jié)合介導(dǎo)單核細(xì)胞-血小板聚集體(monocyteplatelet aggregation，MPA)的形成，其中活化血小板表面表達(dá)的P-選擇素(CD62P)與組成性表達(dá)于單核細(xì)胞的配體P-選擇素受體-1(P-selectin glucoligand-1，PSGL-1)是介導(dǎo)MPA形成的主要分子［1］。MPA的出現(xiàn)及其水平的高低與疾病的急慢性、嚴(yán)重程度、治療效果等方面有相關(guān)性［3］。研究顯示，體內(nèi)活化血小板表面的CD62P數(shù)小時(shí)內(nèi)被剪切掉，而MPA可更長時(shí)間的保留在外周血中［4］，能更長時(shí)間的提示血小板活化。因此，檢測MPA具有重要的臨床價(jià)值。流式細(xì)胞術(shù)是檢測MPA簡便、有效的方法。由于血液離體后的保存放置、不同處理方式等均有可能導(dǎo)致血小板體外活化，從而影響MPA的檢測結(jié)果。因此，我們探討了實(shí)際工作中不同處理方法對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測MPA的影響，為準(zhǔn)確檢測MPA提供依據(jù)。

材料和方法

一、標(biāo)本來源

來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院門診隨機(jī)抽取的新鮮枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈血。

二、儀器與試劑

美國Beckman-Coulter公司EPICS XL流式細(xì)胞儀。OptiLyse溶血?jiǎng)?含1.5%甲醛)，熒光標(biāo)記單克隆抗體CD14-藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、CD61-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、CD62P-PE、CD41-ECD、CD45-ECD以及同型對(duì)照抗體IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-ECD均購自美國Beckman-Coulter公司。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.2～7.4)、1%多聚甲醛依據(jù)文獻(xiàn)［5］由本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

三、方法

1.MPA檢測抽血時(shí)前2 mL血棄去，獲取枸櫞酸鈉抗凝全血標(biāo)本，立即如下處理:(1)溫和顛倒混勻，取每管50 μL，共2管;(2)每管加如下抗體，對(duì)照管加IgG1-FITC 10 μL、CD14-PE 10μL，檢測管加CD14-PE 10 μL、CD61-FITC 10 μL，溫和混勻，室溫(18～25℃)孵育15～20 min;(3)加含1.5%甲醛的OptiLyse溶血?jiǎng)?00 μL，溫和混勻，室溫放置10 min;(4)加PBS 3 mL，混勻，300×g離心5 min，去上清，適量PBS重懸沉淀，上機(jī)檢測。以CD14-PE標(biāo)記單核細(xì)胞，以CD61-FITC標(biāo)記血小板，以CD14-PE/CD61-FITC雙陽性為MPA，計(jì)數(shù)至少1 000個(gè)單核細(xì)胞，記錄MPA數(shù)量占總單核細(xì)胞數(shù)的百分比。

2.血小板活化標(biāo)志物CD62P的檢測與MPA檢測使用同一標(biāo)本。取每管5 μL，加PBS 40 μL，共2管。(1)標(biāo)記抗體:對(duì)照管加CD61-FITC 10 μL、IgG1-PE 10 μL，檢測管加CD61-FITC 10 μL、CD62-PE 10 μL，溫和混勻，室溫(18～25℃)避光孵育15～20 min;(2)溶血固定:加OptiLyse溶血?jiǎng)?00 μL，溫和混勻，室溫放置10 min，加4 mL PBS，混勻，上機(jī)檢測。以CD61-FITC標(biāo)記血小板，以CD62P-PE/CD61-FITC雙陽性為活化血小板，計(jì)數(shù)至少3 000個(gè)血小板，記錄活化血小板數(shù)量占總血小板數(shù)的百分比。

四、不同處理方法對(duì)MPA檢測結(jié)果的影響

以下5組為獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每組均單獨(dú)隨機(jī)抽取3份不同的門診患者的新鮮枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈血檢測。

1.標(biāo)本處理前放置時(shí)間取2管同一患者來源的枸櫞酸鈉抗凝全血，獲取后立即處理，或分別于室溫(18～25℃)和低溫(2～8℃)放置30、60、120 min，檢測各時(shí)間點(diǎn)的MPA和血小板CD62P。

2.標(biāo)本處理后放置時(shí)間標(biāo)本處理后立即檢測或于低溫保存2、4、24 h，檢測各時(shí)間點(diǎn)的MPA。

3.分別于標(biāo)本固定前、后標(biāo)記抗體固定前標(biāo)記抗體的檢測同上述檢測MPA的方法。固定后標(biāo)記抗體操作如下:100 μL全血標(biāo)本加入低溫預(yù)冷的1%多聚甲醛1 mL，輕輕混勻，低溫固定30 min，300×g離心5 min，去上清，加4 mL PBS洗滌1次，立即加抗體孵育，或固定后置低溫保存4及24 h，再加抗體孵育20 min。加溶血?jiǎng)㎡ptiLyse 500 μL，混勻，室溫放置10 min。PBS洗滌1次，去上清，適量PBS重懸沉淀，上機(jī)檢測MPA。

4.標(biāo)記抗體前離心處理對(duì)MPA的影響全血標(biāo)本600×g離心5 min后再顛倒混勻，檢測MPA和血小板CD62P。

5.不同抗體組合檢測MPA的比較采用不同抗體組合標(biāo)記單核細(xì)胞和血小板。組合如下:抗CD14-PE和抗CD61-FITC，抗CD14-PE和抗CD41-ECD，抗CD45 ECD和抗CD61-FITC，操作同前述。采用不同抗體組合標(biāo)記MPA，以CD14-PE標(biāo)記單核細(xì)胞，分別以CD61-FITC和CD41-ECD標(biāo)記血小板，以CD14-PE/CD61-FITC雙陽性、CD14-PE/ CD41-ECD雙陽性為MPA。以CD45-ECD/SSC散點(diǎn)圖界定單核細(xì)胞群，以CD61-FITC標(biāo)記血小板，以CD45-ECD/CD61-FITC雙陽性標(biāo)記MPA。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、標(biāo)本處理前不同放置時(shí)間對(duì)MPA檢測的影響

標(biāo)本分別于室溫(18～25℃)和低溫(2～8℃)保存放置30、60、120 min后處理的MPA檢測結(jié)果與標(biāo)本立即處理的MPA檢測結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。MPA占單核細(xì)胞的百分比、血小板CD62P陽性率均隨放置時(shí)間的延長而增高。室溫與低溫各時(shí)間點(diǎn)MPA百分比與血小板CD62P陽性率呈正相關(guān)(室溫r=0.82，P＜0.05;低溫r=0.83，P＜0.05)。見圖1。

圖1 標(biāo)本處理前放置不同時(shí)間檢測的MPA占單核細(xì)胞的百分率和血小板CD62P陽性率

二、標(biāo)本處理后不同放置時(shí)間對(duì)MPA檢測的影響

標(biāo)本處理后于低溫保存2、4、24 h后再檢測MPA，其結(jié)果與處理后立即檢測比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。見圖2。

圖2 標(biāo)本處理前放置不同時(shí)間檢測的MPA占單核細(xì)胞百分率

三、標(biāo)本固定前、后標(biāo)記抗體的比較

1%多聚甲醛低溫固定全血標(biāo)本后立即孵育抗體，或固定后放置于低溫保存4、24 h再孵育抗體，其MPA占單核細(xì)胞的百分率與固定前孵育抗體比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。見圖3。

圖3 標(biāo)本固定前、后標(biāo)記抗體并檢測的MPA占單核細(xì)胞百分率

四、標(biāo)本標(biāo)記抗體前離心處理

與離心前標(biāo)記抗體比較，全血標(biāo)本離心處理后標(biāo)記抗體，MPA占單核細(xì)胞的百分率和血小板CD62P陽性率均明顯增高(P＜0.05)。見圖4、圖5。

圖4 標(biāo)本離心前、后MPA占單核細(xì)胞的百分率比較

五、不同抗體組合檢測的比較

分別以抗CD14-PE和抗CD61-FITC、抗CD14-PE和抗CD41-ECD、抗CD45-ECD和抗CD61-FITC標(biāo)記檢測MPA。不同抗體組合之間MPA占單核細(xì)胞百分率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。見圖6。

圖5 標(biāo)本離心前、后血小板CD62P陽性率

圖6 不同抗體組合檢測MPA占單核細(xì)胞百分率的比較

討論

多種分子相互結(jié)合介導(dǎo)MPA的形成，其中活化血小板表面表達(dá)CD62P與組成性表達(dá)于單核細(xì)胞配體(PSGL-1)結(jié)合，兩者是介導(dǎo)MPA形成的主要分子［1］。研究顯示，在體內(nèi)，血小板膜表面的CD62P在較短時(shí)間內(nèi)被剪切掉，而循環(huán)中MPA的半衰期卻長于血小板膜表面CD62P［4］，具體機(jī)制不明確，可能與其它分子的作用(包括CD40/CD40L，GP-Ⅰb/CD11b等)有關(guān)。因此檢測外周血的MPA水平能更穩(wěn)定地反映血小板活化［4］。

離體之后的外周血使用枸櫞酸鈉抗凝可抑制血小板的進(jìn)一步活化。在實(shí)際檢測工作中，標(biāo)本獲取后可能不能立即處理。本研究結(jié)果顯示，全血標(biāo)本離體后不論是放置在室溫(18～25℃)還是低溫(2～8℃)保存，保存時(shí)間越長，血小板CD62P陽性率越高，反映出血小板活化增加。MPA的形成亦隨著保存時(shí)間延長而增加，兩者存在一定相關(guān)性。因此標(biāo)本獲取后應(yīng)立即處理。本研究結(jié)果還顯示血小板CD62P陽性率在2 h內(nèi)升高了4倍，而MPA占單核細(xì)胞百分率的水平大約只升高了25%。因此，1個(gè)單核細(xì)胞可能結(jié)合了多個(gè)活化血小板［2］。另外，MPA與CD62P陽性血小板同時(shí)存在，也說明活化血小板并不全都結(jié)合單核細(xì)胞。因此可能導(dǎo)致活化血小板上升幅度高于MPA上升幅度，但兩者仍存在一定相關(guān)性。

使用多聚甲醛固定可阻止血小板的活化。對(duì)于不能立即處理的標(biāo)本可以先固定，便于保存放置。本研究結(jié)果顯示，使用1%多聚甲醛先于低溫固定標(biāo)本處理，可有效抑制血小板的體外活化。可保存至次日再孵育抗體，MPA占單核細(xì)胞百分比未發(fā)生明顯變化。

新鮮全血處理過程中，在孵育抗體后使用含有1.5%甲醛的溶血?jiǎng)┕潭ǎ梢砸环矫孀柚寡“弩w外活化，另一方面也便于檢測前的保存。本研究結(jié)果顯示，將標(biāo)記處理完畢之后的標(biāo)本放置于低溫可保存至次日再上機(jī)檢測。在固定之前應(yīng)避免離心，離心過程中的剪切力可能導(dǎo)致血小板活化［6］。本研究結(jié)果還顯示，離心處理可導(dǎo)致血小板活化增加，MPA形成亦增加。

單核細(xì)胞標(biāo)記物一般使用CD14標(biāo)記，血小板標(biāo)記常用的有CD41、CD61等。本研究結(jié)果顯示，CD14/CD61、CD14/CD41抗體組合之間MPA檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CD45是泛白細(xì)胞標(biāo)記物，CD45/SSC散點(diǎn)圖可將淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞三群更清楚的區(qū)分開來，通過在CD45/SSC散點(diǎn)圖對(duì)單核細(xì)胞設(shè)門，同時(shí)使用CD61標(biāo)記血小板，這種抗體組合同樣可以檢測MPA，結(jié)果與CD14/CD61、CD14/CD41抗體組合比較無明顯差異。此外，該方法可同時(shí)檢測粒細(xì)胞-血小板聚集體。因此實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際已有或者可獲取的熒光標(biāo)記抗體，來選擇適合的抗體組合。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)室在獲取全血標(biāo)本后應(yīng)盡快處理，不能立即處理的應(yīng)使用固定劑固定，固定后可低溫保存24 h，固定前應(yīng)避免離心，處理完畢的標(biāo)本使用固定劑固定后可低溫保存24 h再檢測，不同抗體組合應(yīng)驗(yàn)證后使用，CD14/CD61、CD14/ CD41、CD45/CD61組合均適用于檢測MPA。

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In fluence of different processing techniques on peripheral blood monocyte-platelet aggregation by flow cytometry

LI Linyun，MEI Bing，WANG Changfu.(Department of Clinical Laboratory，Jingzhou Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Technology，Hubei Jingzhou 434020，China)

ObjectiveTo investigate the influence of different processing techniques on monocyte-platelet aggregation(MPA)by flow cytometry in order to provide the reference for the determ ination of MPA.MethodsSodium citrate anticoagulation whole blood samp les were collected random ly.CD14-phycoerythrin(PE)and CD61-fluorescein isothiocyanate(FITC)were used to label monocytes and platelets.CD62P-PE was used to label activated platelets.The percentages of CD14-PE/CD61-FITC-double-positive MPA in monocytes and CD62P-positive platelets were determined by flow cytometry.Different processing techniques were performed as follows.Whole blood samples were prepared immediately after collection or delayed for different times.After preparation，samples were analyzed immediately or delayed for different times.Antibody immunolabeling was performed before fixation of whole blood samples，immediately after fixation or at different delayed times after fixation.Before immunolabeling，whole blood samples were centrifugated or not.Different antibodies，anti-CD14-PE with anti-CD61-FITC，anti-CD14-PE with anti-CD41-ECD and anti-CD45-ECD with anti-CD61-FITC，were used to label MPA.The results of MPA from different processing techniques were compared.ResultsCompared with immediate preparation after blood collection，the percentages of MPA and CD62P-positive platelets increased with the delayed time at room temperature(18-25℃)and low temperature(2-8℃)(P＜0.05)，and there was a positive correlation(room temperature:r=0.82，P＜0.05;low temperature:r=0.83，P＜0.05).Compared with immediate determination after preparation，the percentages of MPA of samples stored at low temperature for 24h after preparation did not alter significantly(P＞0.05).Compared with immunolabeling samples before fixation with 1%paraformaldehyde，no significant change was observed in MPA percentages from immediate immunolabeling after fixation or immunolabeling samples stored at low temperature for 24 h after fixation(P＞0.05).Centrifugation of whole blood samples before immunolabeling resulted in significant increase of the percentages of MPA and CD62P-positive platelets(P＜0.05).MPA percentages resulted from different antibodies had no significant variance (P＞0.05).ConclusionsWhole blood samples should be handled as soon as possible.Fixation with 1% paraformaldehyde at low temperature could store samp les for 24h before handling.Centrifugation should be avoided before immunolabeling.A fter preparation and fixation，samples could be stored at low temperature for 24h before analysis.Different antibody combinations，including anti-CD14-PE/anti-CD61-FITC，anti-CD14-PE/anti-CD41-ECD and anti-CD45-ECD/anti-CD61-FITC，are all suitable for immunolabeling MPA.

Monocyte-platelet aggregation;Flow cytometry;Processing

1673-8640(2015)09-0916-05

R446.11

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.012

2014-11-06)

(本文編輯:范基農(nóng))

湖北省衛(wèi)生廳科研一般項(xiàng)目(JX5B47)

李琳蕓，女，1980年生，碩士，主管技師，主要從事臨床流式細(xì)胞術(shù)檢測和應(yīng)用研究。

王昌富，聯(lián)系電話:0716-8436074。