土荊皮酸對人肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響及其機制

余景偉 胡克

武漢大學人民醫院呼吸科，湖北武漢430060

土荊皮酸對人肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響及其機制

余景偉 胡克

武漢大學人民醫院呼吸科，湖北武漢430060

目的探討土荊皮酸對肺癌細胞系A549細胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機制。方法體外培養的A549細胞，用不同濃度的土荊皮酸（0、4、8、16、32 μmol/L）處理24、48、72 h，MTT法測定其對A549細胞增殖的影響；土荊皮酸（0、4、8、16 μmol/L）處理A549細胞48 h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡和周期，分光光度計檢測Casepase-3相對活性，Western blot法檢測PTEN、Akt、p-Akt的表達。結果土荊皮酸能有效抑制A549細胞增殖，且呈濃度和時間依賴性（P＜0.05）；土荊皮酸作用A549細胞48 h后，細胞凋亡率從14.8%上升至37.7%，顯著高于對照組（土荊皮酸0 μmol/L）（P＜0.05）；流式細胞儀檢測結果顯示，土荊皮酸能抑制細胞的G1期行進和G1/S轉換；Casepase-3相對活性顯著增加（P＜0.05）；土荊皮酸可上調PTEN表達并抑制p-Akt的表達（P＜0.05）。結論土荊皮酸可抑制A549細胞增殖并促進其凋亡，其作用機制可能與上調PTEN并抑制Akt信號通路，繼而阻滯細胞周期并激活線粒體凋亡途徑相關。

土荊皮酸；A549細胞；凋亡；PTEN；Akt信號通路

肺癌是全球范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一［1-2］，化療是主要的治療方法，然而傳統的化療藥物毒副作用大，患者難以耐受，且常常出現耐藥情況，治療效果不佳。因此，從天然植物中尋找高效低毒的具有抗腫瘤活性的成分成為了國內外研究熱點。土荊皮酸（Pseudolaric acid B，PAB）是從荊樹皮中提取的具有多種藥理活性的二萜類化合物，前期研究發現，PAB可抑制多種腫瘤細胞增殖，并誘導細胞凋亡［3-4］，然而其抗腫瘤機制尚不明確，本研究旨在探討PAB對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響，并探討PAB可能的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株：肺癌細胞系A549細胞，購于中國科學院上海細胞庫。主要試劑：PAB購于哈爾濱弘博生物科技有限公司，細胞周期檢測試劑盒和AnnexinV/PI凋亡試劑盒購于BENDER公司；胎牛血清、RPMI1640培養液購于碧云天生物技術研究所；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒、辣根酶標記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG均購自武漢博士德生物科技有限公司；Caspase-3活性檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司；PTEN、Akt、p-Akt（Ser473）及內參β-actin抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養A549細胞培養于含10%胎牛血清RPMI 1640培養基，置于細胞培養箱中培養，對于貼壁細胞培養方法，大約每2天換培養基1次，大約3 d傳代1次，每次均取生長狀態良好的并處于對數期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗檢測細胞活力將對數生長期的細胞配制成1×104個/mL的細胞混懸液，將混懸液按每孔100 μL加入96孔培養板，在孵箱中孵育培養約24 h后取出，棄上清，每孔加200 μL RPMI-1640培養液再培養24 h后取出，棄上清。實驗組換PAB終濃度為2、4、8、16、32 μmol/L培養液，對照組未加PAB（0 μmol/L），每組5個復孔。然后放置培養箱中繼續孵育24、48、72 h，于實驗結束前4 h棄孔內液體，每孔加入100 μL MTT（濃度為0.5 mg/mL），培養4 h，棄孔內液體，加入100 μL DMSO。振蕩15 min后酶標儀測吸光度（A490），根據公式計算細胞抑制率：細胞抑制率（%）=1-（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡將對數生長期的細胞配制成1×106個/mL的細胞混懸液，將懸液接種于6孔板中，在孵箱中孵育培養約24 h后取出，棄上清。實驗組換PAB終濃度為2、4、8、16、32 μmol/L培養液，對照組未加PAB（0 μmol/L），放置培養箱中繼續孵育48 h后收集細胞，預冷PBS洗滌細胞2次，并將細胞重懸于Binding Buffer中。加入5 μL Annexin VFITC室溫、避光反應10 min，加入5 μL PI混勻，室溫、避光反應5 min。篩網過濾后，上流式細胞儀機檢測細胞凋亡率。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期細胞接種及分組同上，收集細胞，洗滌、離心后加入75%預冷乙醇固定過夜，棄掉乙醇，加入RNase和PI室溫避光染色，篩網過濾后，送上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5 分光光度法檢測Caspase-3活性變化細胞接種及分組同上，收集細胞，加入100 μL裂解液+ 1.742 μL PMSF蛋白酶抑制劑重懸細胞，用移液器吹打細胞置混勻，使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上裂解約45 min。后12 000 r/min，4℃離心30 min，后吸取上清，并放置于冰上，用BCA法測定蛋白濃度，根據Caspase-3活性檢測試劑盒操作方法操作，其原理是基于Caspase-3可催化底物Ac-DEVD-pNA并產生黃色的對硝基苯胺（p-nitroaniline，pNA），后者可產生吸光度，間接反映細胞內Caspase-3活性。根據結果調好蛋白濃度（2～4 g/L），再加入緩沖液20 μL多次吹打均勻后加入Caspase-3反應底物Ac-LEHD-pNA 5 μL，再放置培養箱中避光孵育4 h，之后酶標儀測定405 nm處吸光值（OD405）。

1.2.6 Western blot檢測PTEN、Akt和p-Akt（Ser473）蛋白表達細胞接種及分組同上，收集細胞，加入100 μL裂解液+1.742 μL苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑重懸細胞，用移液器吹打細胞置混勻，使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上裂解約45 min。12 000 r/min，4℃離心30 min，后吸取上清，將樣品分裝至預冷的EP管中，-80℃保存。BCA法測定蛋白質濃度，加入1/5體積的5×上樣緩沖液至提取的細胞蛋白樣品中，沸水煮沸5 min，-20℃保存。將細胞蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（上樣量20 μg/孔），電泳結束后轉膜至PVDF膜，再加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，根據條帶蛋白分布不同加入1∶1000稀釋的兔抗或鼠抗人PTEN、Akt、p-Akt（Ser473）抗體，4℃冰箱內過夜，其中β-actin為內參，次日洗膜緩沖液（TBST）洗膜后，根據一抗來源不同分別加入1∶1000稀釋的辣根酶標記的山羊抗或山羊抗鼠二抗，室溫放置2 h，再次TBST洗膜后加入ECL發光液顯色，暗室內顯影并觀察各條帶深淺變化。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PAB對A549細胞活力的影響

如表1所示，PAB對A549細胞的增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時間越長，其發揮抗腫瘤作用效果亦越好。

表1 土荊皮酸對A549細胞增殖的影響

2.2 土荊皮酸對A549細胞凋亡的影響

A549細胞經PAB處理48 h后，流式細胞儀凋亡檢測結果顯示，PAB各實驗組的細胞凋亡率較對照組（0 μmol/L）的凋亡率（0.6%）明顯升高，從14.8%上升至37.7%，較對照組的凋亡率（0.6%）明顯升高（P＜ 0.05）。表明PAB能誘導細胞凋亡。見圖1。

圖1 土荊皮酸對肺癌A549細胞凋亡率的影響

2.3 PAB對A549細胞周期的影響

流式細胞儀檢測細胞周期數據顯示，PAB能抑制A549細胞的G1期行進和G1/S轉換，S期細胞比例降低，表示PAB能夠阻滯細胞周期。見圖2。

2.4 土荊皮酸對A549細胞Caspase-3活性的影響

Caspase-3活性檢測結果顯示，PAB（4、8、16 μmol/L）處理后，A549細胞Caspase-3相對活性較對照組（0 μmol/L）明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 土荊皮酸對肺癌A549細胞周期的影響

2.5 土荊皮酸對A549細胞PTEN、Akt、p-Akt表達的影響

PAB（4、8、16μmol/L）作用A549細胞48h后，Western blot檢測PTEN、Akt、p-Akt，如圖4所示，細胞PTEN表達增加，總的Akt表達量沒有變化，而p-Akt表達減少，呈濃度依賴性，灰度值分析顯示，PAB（4、8、16 μmol/L）與對照組（0 μmol/L）比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。表明PAB能上調PTEN，抑制Akt磷酸化。

3 討論

細胞凋亡機制在維持機體內環境穩定中扮演著重要角色，是重要的生理調控機制［5］，細胞無限增殖及細胞凋亡相對或絕對數不足在腫瘤發生發展中具有重要意義［6］，誘導細胞凋亡可能是抗腫瘤治療最有效的途徑之一，因此，針對誘導細胞凋亡機制的藥物，特別是天然化合物的研究已經成為國內外抗腫瘤研究的熱點。本實驗結果發現，PAB對A549細胞的增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時間越長，其發揮抗腫瘤作用效果亦越好。本研究還檢測了PAB處理A549細胞后細胞周期改變，結果顯示，PAB能阻滯A549細胞的G1期行進和G1/S轉換，導致S期細胞比例降低，提示PAB可能通過阻滯細胞周期抑制細胞增殖。此外，本研究進一步探討了PAB對是否通過誘導細胞凋亡發揮抑制細胞的增殖作用。結果顯示，PAB處理A549細胞后，細胞凋亡率隨著藥物濃度的升高而明顯升高。上述表明PAB能抑制肺癌細胞增殖，同時促進細胞凋亡。

圖3 土荊皮酸對肺癌A549細胞Caspase-3相對活性的影響

圖4 土荊皮酸對肺癌A549細胞PTEN、Akt、p-Akt表達的影響

關于細胞凋亡的途徑及信號通路，目前研究發現的細胞凋亡途徑主要包括內部線粒體途徑、外部死亡受體途徑及內質網應激途徑。Caspase作為半胱氨酸蛋白酶類，其家族在內部線粒體凋亡途徑中起著重要作用，可特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵，是導致凋亡的直接效應物。其中Caspase-3是效應凋亡蛋白酶，其被切割活化后，細胞凋亡則進入不可逆轉階段［7］。Caspase-3在起始凋亡蛋白酶切割激活活化后，可通過裂解細胞凋亡抑制蛋白、細胞DNA修復相關分子、細胞骨架蛋白和細胞外基質蛋白等機制，最終促進細胞凋亡。本研究發現，PAB處理后，A549細胞內Caspase-3活性顯著升高，提示PAB可能通過線粒體途徑誘導肺癌A549細胞凋亡。

本研究進一步探討了PAB引起凋亡的機制。磷酸酶基因（phosphatase and tensin homologue deleted in chromosome，PTEN）是1997年發現并命名的一種具有雙重特異性磷酸酶活性抑癌基因，因其在多種進展期腫瘤中均發生突變，又被稱為多發性進展期腫瘤突變基因（mutated in multiple advanced cancer-1，MMAC-1）。研究發現，PTEN基因在多種腫瘤細胞包括大腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、惡性膠質瘤、肺癌中突變，表達下調甚至缺失［8-11］。已經證實，PTEN發揮抑癌作用主要依靠其磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子PI3P，進而阻斷PI3K/AKT信號通路，即PTENPI3K/AKT信號通路［12-13］。PTEN基因的失活導致PI3K/AKT信號通路異常活化，異常活化的AKT繼而產生促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡，增強腫瘤細胞黏附、侵襲及轉移能力，促進血管生成等多種生物學效應［14］，在腫瘤發生發展過程中具有極其重要意義。本研究發現，PAB處理A549細胞后，細胞PTEN表達上調，同時，細胞總的Akt表達量沒有變化，而p-Akt表達減少，兩者表達呈負相關，表明PAB能上調PTEN從而抑制Akt信號通路。

綜上所述，本研究結果發現PAB可抑制A549細胞增殖，并促進細胞凋亡，其機制可能與PAB上調抑癌基因PTEN從而抑制Akt信號通路，繼而阻滯細胞周期并激活線粒體凋亡途徑相關。有關PAB的潛在抗腫瘤機制尚需進一步深入探索和研究。

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Effects of Pseudolaric acid B on cell proliferation and apoptosis in lung cancer A549 cells and its mechanism

YU JingweiHU Ke
Department of Pneumology,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei Province,Wuhan430060,China

ObjectiveTo investigate the effects of Pseudolaric acid B on the cell proliferation and apoptosis in lung cancer line A549 cells and discuss the possible mechanisms.MethodsA549 cells were cultured in vitro.After treatment by Pseudolaric acid B of different concentrations(0,4,8,16,32 μmol/L)respectively for 24,48,72 h,the influence of Pseudolaric acid B on the proliferation of A549 cells were determined by the MTT method.After treatment by Pseudolaric acid B of different concentrations(0,4,8,16 μmol/L)for 48 h,the cells apoptosis and cycle were detected by flow cytometry;the relative activity of caspase-3 was monitored by spectrophotometer;the expression of PTEN,Akt and p-Aktproteins were detected by the Western blot.ResultsFrom the data of MTT,the cell proliferation of A549 cells was inhibited by Pseudolaric acid B,and in a dose-dependent and time-dependent manner(P＜0.05).Annexin V-FITC/PI staining showed that Pseudolaric acid B significantly induced cell apoptosis.After treated with Pseudolaric acid B,the apoptosis rate of A549 cells increased from 11.6%to 34.5%,which showed an obvious concentration-effect relationship(P＜0.05).Flow cytometry assays demonstrated that Pseudolaric acid B blocked the cell cycle at the G1and G1to S transition,and the percentage of S-phase cells decreased obviously.The relative activity of caspase-3 of Pseudolaric acid B was increased(P＜0.05).The treatment with Pseudolaric acid B promoted the expression of PTEN, and suppressed the expression of p-Aktin a dose-dependent manner(P＜0.05).ConclusionPseudolaric acid B inhibits the cell proliferation and induces cell apoptosis in A549 cells,and the effects of antitumor may be associated with up-regulation of PTEN and inhibition of the Akt signaling pathway,thus blocking the cell cycle and activating mitochondria apoptosis pathway.

Pseudolaric acid B;A549 cell;Apoptosis;PTEN;Akt signaling pathway

R734

A

1673-7210（2015）02（a）-0018-05

2014-10-14本文編輯：任念）

余景偉（1975.5-），男，武漢大學人民醫院呼吸內科2010級在讀碩士研究生；研究方向：呼吸系統疾病及診斷。

胡克（1965.11-），男，醫學博士，教授，博士生導師，武漢大學人民醫院呼吸科主任；研究方向：呼吸系統疾病及診斷。