幾種芽孢桿菌共培養對產蛋白酶的影響

郭建華，趙健喬，曹 政

(1.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 402460;2.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 402460)

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幾種芽孢桿菌共培養對產蛋白酶的影響

郭建華1，趙健喬1，曹 政2*

(1.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 402460;2.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 402460)

[目的]為了研究芽孢桿菌的共發酵對蛋白酶產量的影響。[方法]對4株具有產蛋白酶能力的芽孢桿菌，通過菌株兩兩配伍發酵或三者配伍共發酵培養，分別檢測單一菌株發酵產物和不同菌株共發酵產物的蛋白酶活性。[結果]枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌均具有一定的產蛋白酶能力，枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌共發酵培養48 h后蛋白酶活力有顯著提高。[結論]菌株之間的科學配伍在共發酵中可以顯著提高蛋白酶的活性。

芽孢桿菌；共發酵；蛋白酶

在飼糧的氨基酸不平衡、蛋白質消化不良的情況下，飼糧中50%～70%的氮隨糞、尿排出體外，最終形成污染環境的氨、硫化氫等有臭、有害氣體。發酵床養豬是結合現代微生物發酵處理技術而提出的一種環保、安全、有效的生態養豬法[1]。豬糞中含有豐富的有機質，其中蛋白質含量較高，因而向發酵床接種產蛋白酶高的菌種，能有效地促進有機物降解，加速豬糞腐熟進程，還有利于消除致臭物質，減輕對環境的污染[2]。所以，篩選產蛋白酶高的發酵床菌種，并且進行合理的科學配伍，選出高產蛋白酶配伍方式具有很大的意義。

芽孢桿菌(Bacillaceae)是能形成芽孢(內生孢子)的桿菌或球菌。它們對外界有害因子抵抗力強，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtiliis)、納豆芽孢桿菌(Bacillussubtiliisnatto)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)已被廣泛制作成酶制劑，用于改善動物腸道微生物菌群組成，并且產生蛋白質酶以促進飼糧的消化，彌補體內內原蛋白酶的不足[3-4]。目前的酶制劑有的是單一的菌群，有的是各種細菌的復合制劑，但是各種菌群混合發酵時細菌生長情況和酶學特點目前未見報道。

共培養(Co-culture)是指利用兩種或兩種以上的微生物同時或有先后的加入培養，有效提高資源的利用率，并獲得較高產量的發酵方法。共發酵技術被廣泛用于污水處理、沼氣生產、土壤修復以及傳統食物的生產。與單一菌株發酵相比，不同微生物之間的相互作用可以讓共發酵獲得以外的效果[5]。筆者研究了幾種常見的芽孢桿菌不同組合配比培養條件下細菌的生長情況，同時研究不同發酵組合對生產蛋白酶活性的影響，以獲得最適細菌生長、產蛋白酶最多的菌群組合及其比例，為研究、開發相關微生物制劑產品提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌種的活化與培養條件將實驗室保存的枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌的菌種劃斜面37 ℃培養24 h。供試菌株均采自榮昌縣某零排放養豬場墊料。培養基[3]組成為：1%葡萄糖、0.55%酵母膏、0.5%蛋白胨、0.2%KH2PO4、1%Na2CO3、0.2%MgSO4·7H2O，調整pH 8.0。

1.2 產蛋白酶菌株的配伍分別選取具有產蛋白酶能力菌株活化12 h作為種子液按4%的接種量，兩兩共發酵或三者共發酵接入裝有20 ml液體培養基的50 ml三角錐瓶中(各菌株等量接種)，置37 ℃ 160 r/min進行搖瓶發酵培養，分別培養至24、48 h時取發酵液，測定蛋白酶活性，與菌株單獨發酵的蛋白酶活性進行比較。

1.3 蛋白酶活力測定將培養了24、48 h的各菌株發酵液于4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清液，即為粗酶液。粗酶液蛋白酶活力測定、蛋白酶活力計算方法、酶活力單位的定義均根據文獻[6]進行。

1.4 統計分析對所得結果進行方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單一菌株發酵蛋白酶活性將分離、純化后得到的純種菌株按4%的接種量接入發酵培養基，進行菌株單獨發酵培養，置37 ℃160 r/min搖床振蕩培養后，在培養至24、48 h時提取粗酶液，測定酶活力。由表1可知，實驗室所保存的4種芽孢桿菌發酵液均有蛋白酶活性，發酵24 h內4種芽孢桿菌的蛋白酶活性無顯著性區別，48 h后枯草芽孢桿菌與納豆芽孢桿菌的蛋白酶活性顯著高于地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。

2.2 不同菌株兩兩共發酵蛋白酶活性將菌株兩兩混合進行共發酵培養，測定發酵24、48 h的蛋白酶活性。由表2可知，對菌株兩兩共發酵24 h后，枯草芽孢桿菌與納豆芽孢桿菌發酵液的蛋白酶活性在0.05水平顯著高于其他組合，發酵48 h后它們的蛋白酶活性與其他組相比差異在0.01水平顯著。

表1 單一菌株發酵產物酶活檢測 U/ml

發酵時間∥h枯草芽孢桿菌納豆芽孢桿菌地衣芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌247.56±0.549.21±0.946.35±0.176.25±0.404812.28±0.40*18.56±0.80**7.48±0.267.32±0.14

注：表中數據均為平均值±標準差(n=3)；*P<0.05；**P<0.01。

表2 兩兩混合發酵產物蛋白酶酶活檢測 U/ml

發酵時間h枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌納豆芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌2414.1±0.36*8.96±1.268.42±0.8810.1±0.5710.2±0.336.94±0.424823.3±0.58**12.5±0.4111.4±0.7116.3±0.5115.9±0.688.06±0.63

注：表中數據均為平均值±標準差(n=3)；*P<0.05；**P<0.01。

2.3 3種菌株共發酵蛋白酶活性選取3種純化后的菌株進行混合發酵培養，置于37 ℃ 160 r/min搖床振蕩培養后，在培養至24、48 h時提取粗酶液，測定酶活力。由表3可知，發酵24、48 h的結果差異不顯著，枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發酵液與枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的發酵液在0.05水平顯著高于納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌發酵液的蛋白酶活性。

表3 3種芽孢桿菌共發酵酶活檢測 U/ml

發酵時間h枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌2413.57±0.7013.32±0.698.86±0.224815.40±0.48*14.98±0.60*10.12±0.87

注：表中數據均為平均值±標準差(n=3)；*P<0.05。

3 結論與討論

芽孢桿菌被廣泛用于零排放養殖場墊料中，也被廣泛用于微生態制劑，作為改善腸道微生物的益生菌。所以，研究芽孢桿菌各種生理生化特性對更好地應用益生菌具有重要的理論與實踐意義。該研究對生產實踐中最常見的幾種芽孢桿菌進行各種組合共發酵[7-8]，旨在揭示產蛋白酶效率最高的組合，為生產實踐提供理論指導。

研究中，在發酵培養24、48 h后，單一菌株發酵液中納豆芽孢桿菌蛋白酶活性最大，枯草芽孢桿菌次之，地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌最小。在兩兩發酵試驗中，共發酵24 h后蛋白酶產量均比單一發酵有所提高，其中枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌混合后產量增加顯著，其他五組雖有所增加但增加效果不顯著。在兩兩發酵48 h后，蛋白酶產量比24 h后有所增加，特別是枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌共發酵產蛋白酶量顯著高于其他組合。三種芽孢桿菌共發酵產蛋白酶量普遍遠遠低于兩兩混合發酵產蛋白酶量。由此可知，在產蛋白酶角度上，三種芽孢桿菌共發酵不適宜被應用到實踐生產中去。

[1] 尹紅梅，張國民.生態養豬發酵床菌種產蛋白酶特性的研究[J].湖南農業科學，2010(3):116-118.

[2] 謝金防，熊文華，劉林秀，等.對發酵床養豬技術的認識與思考[J].豬業科學，2008(9)：46-47.

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[5] PANT G,PRAKASH A,PAVANI J V P，et al.Production,optimization and partial purification of protease fromBacillussubtilis[J].J Taibah Univ Sci，2015,9(1):50-55.

[6] 孫曉鳴，王萍，陳靜.納豆芽孢桿菌配伍發酵產中性蛋白酶的性質研究[J].江西農業大學學報，2010,32(1):163-168.

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Influence of SeveralBacillusCo-fermentation on Protease Activity

GUO Jian-hua1, ZHAO Jian-qiao1, CAO Zheng2*

(1. Department of Veterinary Medicine, Southwest University, Rongchang, Chongqing 402460; 2. Chongqing Auleon Biologicals Company Limited，Rongchang, Chongqing 402460)

[Objective] The research aimed to study the influence of severalBacillusco-fermentation on protease yield. [Method] FourBacillussp. who were capable to produce protease were adopted. Through pairwise compatibility fermenting or three strains of fermentation cultivation compatibility，the protease activities were determined together with single strains of fermented products. [Result]Bacillussubtilin,Bacillusnatty,BacilluslicheniformisandBacilluscereushaveall possessed production protease ability. The highest protease activity was achieved when fermentation withBacillussubtilinandBacillusnattyafter 48 h. [Conclusion]Appropriate co-fermentation could significantly improve the protease production activity.

Bacillus；Co-fermentation；Protease

西南大學科研基金資助(08BSr04)。

郭建華(1977-)，男，江西于都人，副教授，博士，從事微生物資源開發與分子生物學研究工作。*通訊作者，研究員，博士，從事微生物分子生物學研究。

2015-02-09

S 154

A

0517-6611(2015)09-011-02