適用于本科教學的新酶促反應動力學實驗研究

吳梅芬, 王曉崗, 劉亞菲, 許新華

（同濟大學 化學系, 上海 200092）

實驗教學研究

適用于本科教學的新酶促反應動力學實驗研究

吳梅芬, 王曉崗, 劉亞菲, 許新華

（同濟大學 化學系, 上海 200092）

通過嚴格的化學反應動力學推導,得到了-糜蛋白酶催化三甲基乙酸對硝基苯酯水解反應相關的動力學參數的表達式,包括表觀米氏常數KM、酶-底物絡合物穩定常數K、催化速率常數kcat、以及基元反應步驟速率常k2和k3等。實驗在25 ℃,pH =8.5的三羥基氨基甲烷緩沖液中進行,用分光光度法測定反應的動力學曲線。數據經過非線性擬合和線性擬合,得到相關的動力學參數,該參數與理論預測一致。該實驗酶制劑價格低廉,活性穩定,實驗方法簡單,可作為本科物理化學實驗課程中復雜反應動力學測量的一個很好的實例,加深學生對化學反應動力學相關理論和概念的理解和掌握。

酶催化； 復雜反應； 化學反應動力學； 實驗教學

酶催化反應動力學實驗能夠生動展示復雜反應過程的細節,是學生理解化學反應動力學理論的良好實例[1-2]。國內高校在生化專業實驗課程中開設的酶促反應動力學實驗,實驗方法均以生化實驗技術為主[3-8]。但是,這些實驗的設計根據的是并不準確的米開利-蒙頓（Mechaelis-Menten）機理[9],也并不嚴格遵循化學反應動力學的原則,實驗測定時往往以產物濃度對反應時間的比值作為瞬時反應速率，不夠嚴謹。在國內高校的物理化學實驗教材中,酶催化反應的實驗項目比較少[10],實驗對象以蔗糖酶為主。由于實驗課時有限等原因,酶的提取和純化過程重現性較差,實驗教學效果不夠理想。

本文提出一種適用于高校本科教學的酶促反應動力學新實驗——-糜蛋白酶催化酯類化合物水解反應實驗。實驗采用物理化學實驗的常用方法——分光光度法,催化劑是商品化的酶制劑,品質有保證且價格較低,能夠滿足眾多學生實驗的成本控制需求。更為重要的是,經過對該反應機理的深入研究,該方法不符合簡單的米開利-蒙頓機理,這就使得學生在分析實驗數據時,必須嚴格按照化學動力學原則進行邏輯分析。由于該反應機理足夠復雜,包含多種常見復雜反應類型（如對峙反應、連續反應等）,對學生全面理解和掌握化學動力學原理和計算方法是一個很好的訓練。

1 反應機理和動力學模型

本文采用的酶催化底物為三甲基乙酸對硝基苯酯（4-nitrophenyl-trimethylacetate,用S表示）,在-糜蛋白酶（-Chymotrypsin,用E表示）的催化下水解生成對硝基苯酚（4-nitrophenol,用P1表示）和三甲基乙酸（trimethylacetic acid,用P2表示）,反應在pH=8左右的堿性緩沖水溶液中進行,生成的產物以其共軛堿的形式存在。反應方程如下:

實驗測得,當酶與底物混合后,產物P1立刻有“爆發性”的增長,然后P1的濃度進入平緩增長期。這個現象不符合傳統的米開利-蒙頓機理。根據Bender及其同事提出的-糜蛋白酶催化反應動力學模型[11-13],可以假設如下反應機理:

可逆酶-底物鍵合

AE表示乙酰化酶假定底物初始濃度遠遠大于酶初始濃度,即C0（S）?C0（E）,為推導P1濃度C（P1）與時間t之間的關系,寫出微分方程:

（1）

（2）

（3）

酶的物質平衡關系為

C0（E）=C（E）+C（ES）+C（AE）

（4）

第一步快速預平衡步驟有

（5）

根據式（1）—式（5）,可以得到:

（6）

（7）

式中參數

（8）

將方程（7）代入方程（1）,積分后得到

C（P1）=mt+n（1-e-b t）

（9）

式中

（10）

圖1是根據方程（9）繪制的曲線,與實驗測定結果完全相符。

圖1 產物P1濃度與時間關系曲線

2 動力學參數計算方法

如果底物同時進行著酶催化水解反應和非催化水解反應,這兩個反應都產生P1,能夠被光譜儀檢測。當計算酶催化動力學參數時,必須先扣除非催化水解反應的本底數據。

C0（E）act=xC0（E）total

（11）

式中x是粗酶原料的純度百分數。通過動力學測量,可以估算x值。

如果固定粗酶濃度C0（E）total,然后測定一系列初始濃度C0（S）下的C（P1）-t關系曲線,通過曲線擬合得到一系列m、n、b參數。

首先考慮m,將參數a、b的定義式（8）代入方程（10）,并變形為

（12）

式中

（13）

m的量綱是“濃度時間-1”（如mol·dm-3·s-1）,與反應速率量綱相同。以作圖得一直線,由直線的斜率和截距可以計算出表觀米氏常數KM；如果已知活性酶濃度C0（E）act,則可以計算出催化速率常數kcat。

n≈C0（E）cat

（14）

即由參數n能夠直接得到活性酶濃度C0（E）act,根據方程（11）可以估算粗酶的純度百分數x,并可計算出kcat。

若僅測量一個底物初始濃度的實驗曲線,在C0（S）?KM條件下,m可以簡化為

m=kcatC0（E）act

（15）

如果已知活性酶濃度C0（E）act,就可以由m直接計算出kcat。

按同樣方法將b參數也表達成雙倒數形式

（16）

3 儀器與試劑

紫外可見分光光度計（Agilent 8453）,三羥甲基氨基甲烷（A.R.）,鹽酸（A.R.）,三甲基乙酸對硝基苯酯（A.R.）,對硝基苯酚（A.R.）,-糜蛋白酶（800 usp unit/mg,阿拉丁試劑）。

4 實驗步驟

（1）配制溶液。溶液a:濃度為0.01 mol·dm-3、pH=8.5的三羥甲基氨基甲烷（TRIS）緩沖液,pH值用鹽酸調節；溶液b:用乙腈溶解三甲基乙酸對硝基苯酯,配成濃度約為3×10-3mol·dm-3的溶液；溶液c:取50 mg-糜蛋白酶用水稀釋至1 mL,酶濃度2.0×10-3mol·dm-3,冰水浴冷卻備用。

（2） 測定實驗條件下對硝基苯酚的吸光系數。用TRIS緩沖液配制濃度約為3×10-5mol·dm-3的對硝基苯酚溶液,在分光光度計上測定溶液的吸光度,并計算吸光系數,測定波長400 nm,以TRIS緩沖液為參比。

（3） 測定非催化條件下酯水解反應的本底曲線。在干凈的石英比色皿中加入3 mL溶液a,然后加入100 μL溶液b,混合均勻。在25C下定波長400 nm測量溶液的吸光度隨時間變化曲線,共計記錄約2 000 s。

（4） 測定酶催化條件下酯水解反應的動力學曲線。在干凈的石英比色皿中加入3 mL溶液a和40 μL溶液b,混合均勻,然后立即注入80 μL溶液c并混合均勻。25C下定波長400 nm測量溶液的吸光度隨時間變化曲線,共計記錄約2 000 s,起始時間為注入溶液c的時刻。反應條件下粗酶濃度為5×10-5mol·dm-3。

控制其他條件不變,將溶液b的加入體積依次改變為50、60、70、90、100 μL,測定不同底物濃度下的酶催化酯水解反應動力學曲線。

5 結果與討論

圖2 不同初始底物濃度條件下產物對硝基苯酚（P1）濃度隨反應時間變化曲線

表1 不同初始底物濃度下的擬合參數

校正確定系數Adj.R2=0.975 48

校正確定系數Adj.R2= 0.943 86

圖3 1/m-1/C0（S）關系線性擬合曲線

圖4 1/b-1/C0（S）關系線性擬合曲線

KM=1.86×10-5mol·dm-3

kcat=5.90×10-4s-1

K=1.01×10-4mol·dm-3

k2=2.06×10-2s-1

k3=6.32×10-4s-1

由此可見k2?k3,kcat≈k3,且kcat略小于k3,與理論預測一致。

根據方程（11）,可以估算粗酶的純度x= 34%。

6 結論

（

）

[1] Murray R K, Granner D K, Mayes P A,et al. Harper’s Illustrated Biochemistry[M]. 26th ed. New York: McGraw-Hill Co,2003.

[2] Atkins P, Paula J. Physical Chemistry[M].7th ed.New York: W H Freeman and Company,2002.

[3] 蔣立科,楊婉身.現代生物化學實驗技術[M].北京:中國農業出版社,2003:267-281.

[4] 張蕾,劉昱,蔣達和,等.生物化學實驗指導[M].武漢:武漢大學出版社,2011:142-183.

[5] 何獻君,呂光璞,陳雅惠.過氧化物酶酶促動力學實驗的設計[J].實驗技術與管理,2009,26（6）:33-35.

[6] 胡曉倩,陳雅蕙,鄧愛平,等.谷胱甘肽轉硫酶酶促動力學實驗設計[J].實驗技術與管理,2002,19（1）:27-31.

[7] 周海夢,周廣業.兔肌肌酸激酶分離純化和部分性質的測定:努力將科研成果轉化為高水平的教學實驗[J].實驗技術與管理,1999,16（2）:30-33.

[8] 袁昕,呂鍇林,趙立青.糖原磷酸化酶b分離純化方法的建立及其在本科實驗教學中的實踐[J].實驗室科學,2008,11（6）:84-85,87.

[9] 彭笑剛.物理化學講義[M].北京:高等教育出版社,2012:660-668.[10] 蔡顯鄂,項一非,劉衍光.物理化學實驗[M].2版.北京:高等教育出版社,1992:121-126.

[11] Zerner B, Bender M L. The Kinetic Consequences of the Acyl-Enzeme Mechanism for the Reactions of Specific Substrates with Chymotrypsin[J].Journal of the American Chemical Society, 1964,86:3669-3673.

[12] Zerner B, Bond R P M. Kinetic Evidence for the Formation of Acyl-Enzyme Intermediates in the-Chymotrypsin-Catalyzed Hydrolyses of Specific Substrates[J]. Journal of the American Chemical Society, 1964,86:3674-3679.

[13] Bender M L, Clement G E, Kézdy F J,et al. The Correlation of the pH（pD） Dependence and the Stepwise Mechanism of-Chymotrypsin-Catalyzed Reactions[J]. Journal of the Amrican Chemical Society, 1964,86:3680-3690.

[14] Bender M L, Kézdy F J, Wedler F C.-Chymotrypsin: Enzyme Concentration and Kinetics[J].Journal of Chemical Education, 1967,44:84-88.

Research on a novel kinetics experiment of enzyme-catalyzed reaction presented for undergraduate teaching

Wu Meifen, Wang Xiaogang, Liu Yafei, Xu Xinhua

（Department of Chemistry,Tongji University,Shanghai 200092,China）

The mechanism of-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of 4-nitrophenyl trimethylacetate includes the following steps: the reversible enzyme-substrate binding and the enzyme acylation and enzyme deacylation. This mechanism is quite different from the conventional Michaelis-Menten mechanism for enzyme-catalyzed reactions. The corresponding kinetic parameters can be expressed precisely on the basis of chemical kinetics theory, such as Michaelis constantKM, equilibrium constantK, catalytic rate constantkcat, and the rate constants of the elementary reactionsk2andk3. The reaction is carried out at 25C in a pH = 8.5 buffer of tris（hydroxymethyl）aminomethane （TRIS） by means of spectrophotometry. The kinetic curves are fitted linearly and non-linearly. The kinetic parameters are in agreement with the theoretical prediction. The enzyme product used in this experiment is cheap and the activity is stable. The experimental method is simple enough to be applied in undergraduate physical chemistry laboratory courses. As an ideal model of complex reaction, the experiment will help the students to enhance the understanding and knowledge of chemical kinetics theories.

enzyme-catalysis; complex reaction; chemical kinetics; experimental teaching

2015- 04- 07

同濟大學第八期精品實驗項目建設（1380104084）；同濟大學實驗教改項目建設（1380104081）

吳梅芬（1970—）,女,上海,博士,高級工程師,從事物理化學實驗教學工作

E-mail：wumf@tongji.edu.cn

許新華（1967—）,男,浙江黃巖,博士,副教授,從事物理化學及實驗的教學工作.

E-mail：xxh01@tongji.edu.cn

O642; TG146

A

1002-4956（2015）11- 0170- 04