響應面優化超聲輔助提取刺梨多糖工藝研究

唐健波，肖 雄，楊 娟，彭 梅*，劉建華

1 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴陽 550002;2 貴州省生物技術研究所，貴陽 550006

刺梨(Rosa roxburghii Tratt，RRT)是貴州特色水果資源，號稱維C 之王，在貴州已有較大規模種植栽培，資源十分豐富。刺梨為衛生部批準的食品新資源名單品種，為藥食兩用植物，具有醫藥保健功能，尤其在增強免疫力、抗動脈粥樣硬化、延緩衰老、抗癌防癌、抗突變等方面功效顯著［1-3］，在食品、保健食品、醫藥領域中得到廣泛應用。多糖作為刺梨中主要藥理成分之一，具有抗氧化［4］、抗缺氧［5］、抗應激、免疫調節［6］、神經營養活性［7］以及對神經干細胞谷氨酸損傷有保護作用［8］等多方面的生物活性，具有很好的開發利用價值。目前對刺梨多糖(Rosa roxburghii Tratt polysaccharide，RRTP)的提取工藝報道很少，主要還是沿用傳統的熱水提取法［9］，有關超聲波輔助提取刺梨多糖的工藝研究還未見報道。

超聲波提取是利用超聲波具有的機械效應、空化效應及熱效應，通過增大介質分子的運動速度，增大介質的穿透力以提取天然產物有效成分的方法［10］。本文以刺梨為試驗材料，通過對刺梨多糖超聲提取過程中超聲時間、超聲功率、液料比、提取溫度、提取次數等因素與刺梨多糖提取率關系的研究，結合響應面對刺梨多糖提取工藝的優化篩選，旨在獲得最佳提取工藝，為貴州省特色果實刺梨的綜合利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

刺梨干果于2012 年9 月購自貴陽市萬東橋藥材市場;濃硫酸、苯酚、葡萄糖、乙醇均為國產分析純;SB25-12DTD 超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司;HP-8453 型紫外可見分光光度計，惠普公司;MD spectra MAX-190 連續波長酶標儀，美國MD公司;AL204 梅特勒電子分析天平，梅特勒·托利多儀器(上海)有限公司;DZF-6021 型真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司，TDL-40C 低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理

刺梨干果7400 g 經粉碎后，用80%乙醇回流提取8 次，每次2 h，抽濾得固體粉末，經干燥后得樣品3500 g，保存備用。

1.2.2 刺梨多糖的提取流程及方法

刺梨多糖超聲波輔助提取工藝流程為:刺梨→干燥、粉碎→乙醇回流除雜→抽濾→殘渣通風干燥→超聲輔助提取→離心、抽濾→濾液減壓濃縮→醇沉、抽濾→濾餅真空干燥→粗多糖。

取預處理后的樣品5 g，放入500 mL 梨形瓶中，加入適量水，放入超聲波清洗機中，在一定功率下提一定時間，趁熱于4000 rpm 下離心10 min，取上清液抽濾，收集濾液，殘渣按上述方法再重復提取2次。合并濾液，減壓濃縮至一定體積，加入一定量的無水乙醇使溶液中乙醇最終濃度達到80%。靜置過夜，抽濾，沉淀用無水乙醇洗滌2～3 次后，60 ℃真空干燥至恒重，稱重。同時用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.2.3 多糖含量測定方法

采用苯酚-硫酸法，稱取粗多糖10 mg 溶于50 mL 容量瓶中制得0.2 mg/mL 的樣品溶液，取0.8 mL 于試管中，蒸餾水補液至2 mL，然后加入6%的苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，靜置10 min 后搖勻。冷卻至室溫后于490 nm 測定吸光度，平行測定三次，以2.0 mL 蒸餾水做空白對照。

標準曲線的繪制:準確稱取干燥至恒重的葡萄糖100 mg 溶于50 mL 容量瓶中，混勻后取1.0 mL稀釋至50 mL 制得0.04 mg/mL 的葡萄糖溶液，分別取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以蒸餾水補液至2.0 mL，然后依次加入6%的苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，靜置10 min 后，搖勻，室溫放置冷卻至室溫后于490 nm 測定吸光度，以2.0 mL 蒸餾水做空白對照。橫坐標為葡萄糖濃度，縱坐標為吸光度，繪制得標準曲線。

1.2.4 試驗設計

試驗選用超聲時間、超聲功率、液料比、提取次數及提取溫度對提取率起主要影響的5 個因素，以刺梨多糖的提取率為考察指標，進行單因素考察。在單因素試驗結果的基礎上，采用Box-Benhnken 中心組合試驗設計方案，對超聲輔助提取刺梨多糖的影響因素進行了更為深入的研究和條件優化。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲時間對刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定液料比30 mL/g，提取時間10 min，提取溫度60 ℃，提取次數3 次，考察不同的超聲時間對多糖提取率的影響。由圖1 可看出，隨著超聲時間的延長，吸光度值快速上升，到了20 min 左右時，吸光度值基本保持不變，因此確定超聲時間為20 min。

圖1 超聲時間對刺梨多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction yield of RRTP

2.1.2 超聲功率對刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定液料比30 mL/g，提取時間20 min，提取溫度60 ℃，提取次數3 次，考察不同的超聲功率對多糖提取率的影響。由圖2 可看出，隨著超聲功率的升高，吸光度值先略有升高，之后快速下降，在240 W 時有一個峰值，說明在功率240 W 時提取率達到最高。分析原因可能是因為高功率的超聲波對刺梨多糖有一定的破壞作用，從而導致多糖得率的下降。

圖2 超聲功率對刺梨多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of RRTP

2.1.3 液料比對刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定提取時間20 min，提取溫度60℃，超聲功率240 W，提取次數3 次，考察不同的液料比對多糖提取率的影響。由圖3 可看出，隨著液料比的升高，吸光度值先上升，然后逐漸下降，在液料比為30 mL/g 時吸光值最大，說明此時的提取率最高。分析原因可能是隨著液料比的升高，其他成分的溶出也相對增多，從而抑制了多糖的溶出。因此確定液料比為30 mL/g。

圖3 液料比對刺梨多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on extraction yield of RRTP

2.1.4 提取次數對刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定提取時間20 min，提取溫度60℃，超聲功率240 W，料液比30 mL/g，考察不同的提取次數對多糖提取率的影響。由圖4 可看出，隨著提取次數的增加，吸光度值先逐步升高，在提取次數達到3 次時，吸光度值趨于穩定，說明提取3 次后提取率基本不再上升，而隨著提取次數的增加所耗費的成本也急劇增加，綜合各種因素考慮選定提取3 次為宜，既減少后期濃縮的困難，又節省能耗。

圖4 提取次數對刺梨多糖提取率的影響Fig.4 Effect of times of extraction on extraction yield of RRTP

2.1.5 提取溫度對刺梨多糖提取率的影響

取樣品5 g，固定提取時間20 min，超聲功率240 W，料液比30 mL/g，提取次數3 次，考察不同的提取溫度對多糖提取率的影響。由圖5 可看出，隨著提取溫度的升高，吸光度值快速上升，達到60 ℃后上升趨勢減緩，上升到80 ℃時達到所取范圍內的最高值。分析原因是:隨著溫度的升高，熱效率升高，分子運動速度加快，利于刺梨多糖的溶出，但溫度過高可能對多糖結構造成一定的破壞，影響其藥理活性，綜合考慮后選擇70 ℃為中心點進行響應面試驗。

圖5 提取溫度對刺梨多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction yield of RRTP

2.2 刺梨多糖提取工藝響應面法優化

根據Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選取超聲時間、超聲功率、液料比、提取溫度這4 個因素，采用4 因素3 水平的響應面分析方法求取優化的工藝參數，響應面試驗因素水平見表1，Box-Benhnken 設計及試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Levels and code of response surface experiments

表2 Box-Benhnken 設計及試驗結果Table 2 Box-Benhnken experiment design and the results

表3 方差分析表Table 3 ANOVA of regression analysis

注:* P＜0.05 顯著作用;＊＊ P＜0.01 高度顯著作用;＊＊＊ P＜0.001 極顯著作用。Note:* P＜0.05 significant effect;＊＊ P＜0.01 very significant effect;＊＊＊ P＜0.001 extremely significant effect.

利用軟件Design-Expert8.06 程序進行試驗設計與數據分析，經對各因素回歸擬合后，得到回歸方程為:

從表3 可以看出，模型的F 檢驗結果為P＜0.0001，表明該回歸方程模型極其顯著，且模型失擬項P=0.5885＞0.05 不顯著，復相關系數R2=0.9770，說明模型擬合程度很好。校正系數0.9539 說明該模型能解釋95.39%響應值的變化，僅有總變異的4.61%不能用此模型來解釋。因此試驗值與預測值非常接近，可以用此模型來分析和預測超聲波輔助提取刺梨多糖的工藝條件。由表3中的回歸模型方差分析結果可知，X1、X2、X3、X4、對刺梨多糖提取率的影響均顯著。

RSM 的圖形是特定的響應面Y 對應X1、X2、X3、X4值構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素對響應值的影響，從所得響應面分析圖上可以分析出它們之間的相互作用。

圖6 超聲功率和超聲時間對刺梨多糖提取率的影響Fig.6 Response surface plot and contour plot effect of ultrasonic power and ultrasonic time on extraction yield of RRTP

圖7 液料比和超聲時間對刺梨多糖提取率的影響Fig.7 Response surface plot and contour plot effect of liquid to solid ratio and ultrasonic time on extraction yield of RRTP

圖8 提取溫度和超聲時間對刺梨多糖提取率的影響Fig.8 Response surface plot and contour plot effect of extraction temperature and ultrasonic time on extraction yield of RRTP

圖9 液料比和超聲功率對刺梨多糖提取率的影響Fig.9 Response surface plot and contour plot effect of liquid to solid ratio and ultrasonic power on extraction yield of RRTP

圖10 提取溫度和超聲功率對刺梨多糖提取率的影響Fig.10 Response surface plot and contour plot effect of extraction temperature and ultrasonic power on extraction yield of RRTP

圖11 提取溫度和液料比對刺梨多糖提取率的影響Fig.11 Response surface plot and contour plot effect of extraction temperature and liquid to solid ratio on extraction yield of RRTP

從響應面分析圖6～11 中可以看出響應值與影響因素的關系:提取溫度對刺梨多糖提取率的影響最為顯著，表現為曲線較陡，其次依次超聲時間、超聲功率、液料比，表現為曲線較平緩。

根據所得模型，應用Design-Expert 軟件分析可預測在穩定狀態下的最優工藝條件是:超聲時間30 min，超聲功率132.93 W，液料比40 mL/g，提取溫度80 ℃，提取3 次，刺梨多糖預測提取率為2.19%。

為了檢測試驗結果與真實情況的一致性，根據以上試驗結果結合實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為:取超聲時間30 min，超聲功率120 W，液料比40 mL/g，提取溫度80 ℃，提取3 次。在此條件下進行3 次平行試驗，得刺梨多糖提取率為2.18%。提取率與預測結果契合度為99.54%，二者非常接近，說明該工藝穩定可行，適合刺梨多糖的提取。

3 結論

本研究首先通過單因素試驗選定了參與響應面試驗的提取溫度、超聲功率、超聲時間、液料比4 個主要因素并設立不同水平，然后應用響應面分析法建立了刺梨多糖提取率的二次多項數學模型，經檢驗該模型具有顯著的統計學意義，可用于生產預測。

試驗結果表明提取溫度、超聲功率、超聲時間、液料比各因素對刺梨多糖提取率均有顯著影響。綜合考慮各方面的因素，超聲輔助提取刺梨多糖的最優工藝為:超聲時間30 min，超聲功率120 W，液料比40 mL/g，提取溫度80 ℃，提取3 次，此條件下的刺梨多糖提取率可達2.18%。該結果可為刺梨多糖的提取研究提供一定的參考價值，具有一定的實際應用前景。

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