響應面法優化茶多酚乙酰化工藝條件

朱 媛，張雪松，黃小忠

1 南京曉莊學院，南京 210017;2 江蘇農林職業技術學院，句容 212400

自由基是機體氧化反應中產生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應。而DPPH 自由基在實驗室研究中用于抗氧化成分的體外抗氧化性評價。由于化學合成的抗氧化劑存在致癌、毒副作用等安全問題因而，天然抗氧化劑是減輕細胞氧化損傷、預防相關疾病和延緩衰老的最有效措施［1］。茶多酚是一種從茶葉中提取的天然抗氧化劑，已經得到許多領域的應用。兒茶素類是茶多酚的主要功能物質，此類物質脂溶性較差，如果直接添加到油相中，會出現凝聚和沉淀現象，會降低茶多酚的抗氧化性能［2，3］。

目前，分子修飾是國內外改造物質性質的重要途徑，是改變物質生物學活性的重要手段。一般常用的改性方法有溶劑法、乳化法、分子修飾法等［4-7］。通過茶多酚改性，一方面可以提高物質的原有特性使其作用效果更高更好，另一方面通過引入各種功能集團而賦予其新的生理活性，從而擴大其應用范圍。本文以乙酸酐為酰化劑，對茶多酚進行乙酰化改性研究。利用響應面分析法，以衡量產物抗氧化能力的DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)自由基抑制率為參數，優化茶多酚乙酰化工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 材料

大豆油:起始過氧化物值(POV)為3.04 mmol/kg。

1.2 儀器與試劑

RE-5203 旋轉蒸發儀(上海亞榮)，WFG7200 分光光度計(上海尤尼柯)，DZG-6050SA 真空干燥箱(上海森信)，KQ3200E 超聲波振蕩儀(昆山超聲儀器有限公司)。茶多酚(＞98%，上海惠誠)，乙酸酐、乙酸乙酯(AR，江蘇強盛)、吡啶、氯仿(AR，上海凌峰)。

2 實驗方法

2.1 茶多酚乙酰化合成工藝及精制

乙酸酐為酰化劑，乙酸乙酯為溶劑、吡啶為催化劑，回流加熱。反應結束后，用少量水洗滌，靜止分層，取乙酸乙酯層，經減壓蒸餾、真空干燥后獲得產品。

2.1.1 單因素實驗

依次改變原料液料比、吡啶用量、反應時間及反應溫度四個因素，測定乙酰化產物的DPPH 自由基抑制率值。

2.1.2 響應面法優化

綜合單因素實驗結果，采用Design-Expert V8.0進行實驗設計，響應面實驗因素水平如表1 所示。液料比、催化劑吡啶用量、反應溫度、反應時間分別對應實驗中因素的A、B、C、D，DPPH 自由基抑制率為衡量指標。

表1 茶多酚乙酰化響應面實驗因素水平表Table 1 Factor level of acetylated tea polyphenols

2.2 DPPH 自由基抑制率測定［8］

將待測樣品用無水乙醇配置成1 g/L，再用乙醇稀釋成一定濃度，作為待測定樣品溶液。

測定:樣品溶液+DPPH 溶液各2 mL 為Ai(為樣品抑制吸收值);樣品溶液+無水乙醇2 mL 為Ac(為樣品對照);DPPH 溶液+無水乙醇各2 mL 為Aj(為無抑制吸收值);4 mL 無水乙醇為無抑制吸收值對照。分別充分振蕩混勻，室溫靜止30 min 后在517 nm 處測定吸收值(每個測定設兩個重復)。DPPH 自由基抑制率按以下公式計算:抑制率=(Aj-Ai)/Aj。

2.3 產物脂溶性的測定

稱取10 mg 干燥后的產品，溶于10 mL 氯仿中，超聲10 min 使其溶解，配成濃度為1g/L 的溶液或懸液，震蕩器上震蕩混勻后用紫外分光光度計測定溶液或懸液800 nm 下的透光率。

2.4 油脂抗氧化測定

按GB/T5538-2005/ISO3960-2001 進行油脂過氧化值(POV)測定，將樣品按GB2760-2007《食品添加劑使用標準》的最大允許量溶于無抗氧化劑大豆油中，在63 ℃下每隔24h 測定POV 值，測定樣品抗氧化值［8］。按食用油衛生標準規定，油脂中POV 達到11.8mmol/kg 時所需時間為誘導時間，即活性氧法(active oxygen method，AOM)值，計算保護系數(PF):PF=添加抗氧化劑的AOM 值/未添加抗氧化劑的AOM 值。

3 結果與分析

3.1 單因素實驗結果

料液比(A)、吡啶用量(B)、反應時間(C)及反應溫度(D)對產物DPPH 自由基抑制率的影響見圖1(A～D)。由圖可知，經過改性之后的產物DPPH自由基抑制率優于未改性的茶多酚。隨著料液比、吡啶用量、反應時間以及反應溫度的增加，反應產物DPPH 自由基抑制率均先升高后降低。當料液比、吡啶用量、反應時間以及反應溫度分別為1∶8，0.3 g，2 h 以及60 ℃時，DPPH 自由基抑制率達到最大。

3.2 響應面實驗優化茶多酚乙酰化工藝條件

3.2.1 響應面實驗設計及結果

茶多酚乙酰化響應面實驗設計及結果見表2。

圖1 料液比(A)、吡啶用量(B)、反應時間(C)及反應溫度(D)對產物DPPH 自由基抑制率的影響Fig.1 Effects of solid-to-liquid ratio(A)，pyridine dosage(B)，reaction time(C)and temperature(D)on DPPH free radical scavenging rates of the synthesized compound

表2 響應面實驗設計結果Table 2 Response surface experimental results of acetylated tea polyphenols

3.2.2 方差分析

對表2 數據運用Design-Expert V8.0 軟件進行方差分析，結果見表3、表4。

表3 模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

P＜0.05，說明對應的因素對響應值影響顯著。從方差分析來看由于所選擇模型顯著，失擬項不顯著，即所選擇的模型可靠。在液料比、吡啶用量、反應時間以及溫度四個因素中，液料比、吡啶用量和反應溫度的影響顯著。此外，四個因素對改性產物DPPH 自由基抑制率的影響也不是簡單的線性關系，諸因素之間的交互影響也較為顯著。

表4 R2 綜合分析表Table 4 Analysis of R2

從表4 可以看出，模型的R2=0.9960，R2校正=0.9921，R2預測與R2校正較為接近，信躁比為48.586(＞4)可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗誤差較小，故可用此模型對乙酰化茶多酚的工藝條件進行優化與預測。

利用Design Expert V8.0 軟件對表2 所得實驗數據進行多元回歸擬合分析，獲得微波提取茶多酚的多元二次回歸方程模型:DPPH 自由基抑制率=-7.97363+0.22601×A+6.57248×B-0.067910×C+0.22731×D+0.18100×A×B+0.068050×A×C+3.58375E-003×A×D-0.50650×B×C+0.068400×B×D+9.11500E-003×C×D-0.038633×A2-17.65817×B2-0.22108×C2-2.41669E-003×D2。

3.2.3 響應曲面圖及其等高線圖

根據回歸方程，獲得響應曲面圖及等高線圖，考察液料比、吡啶用量、反應時間、反應溫度以及交互作用對DPPH 自由基抑制率的影響，如圖2～7 所示。

3.2.3.1 液料比和吡啶用量對DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖2 為吡啶用量和液料比對改性產物DPPH 自由基抑制率的響應曲面和等高線圖。當反應時間與溫度為最佳值時，隨著吡啶用量以及液料比的增加，產物的DPPH 自由基抑制率均出現顯著的變化，抑制能力先增大后減小。由圖2 可以確定最佳水平范圍吡啶用量0.27～0.36 g，料液比為1∶7.3～1∶9.1。

圖2 液料比和吡啶用量對DPPH 自由基抑制率響應曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.2 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of liquid-to-solid ratio and pyridine dosage on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.3.2 時間和液料比對DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖3 為時間和液料比對改性產物DPPH 自由基抑制率的響應曲面和等高線圖。當溫度與吡啶用量為最佳值時，隨著時間及液料比的增加，改性產物對DPPH 自由基抑制率均呈現出先增大后減小的現象。由圖3 可以確定最佳水平范圍時間為1.58～2.38 h，液料比為7.23～9.08。

圖3 時間和液料比對DPPH 自由基抑制率響應曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.3 T Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of reaction time and liquid-to-solid ratio on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.3.3 溫度和液料比對DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖4 為溫度和液料比對DPPH 自由基抑制率影響的響應曲面和等高線圖。當時間與催化劑用量為最佳值時，隨著溫度和液料比的增加，改性產物的DPPH 自由基抑制率均先增大后減小。由圖4 可以確定最佳水平范圍溫度為52～65 ℃，液料比為7.3～9.1。

圖4 溫度和液料比對DPPH 自由基抑制率響應曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.4 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of reaction temperature and liquid-to-solid ratio on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.3.4 時間和吡啶用量對DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖5 為時間和吡啶用量對改性產物DPPH 自由基抑制率的響應曲面和等高線圖。當溫度與液料比為最佳值時，隨著吡啶用量的變化，改性產物DPPH自由基抑制率先增大后減小。而當時間改變時，產物的DPPH 自由基抑制率同樣是先增大后減小，但變化相對不是很顯著。由圖5 可以確定最佳水平范圍時間為1.58～2.34 h，催化劑用量為0.27～0.36 g。

圖5 時間和吡啶用量對DPPH 自由基抑制率響應曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.5 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of reaction time and pyridine dosage on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.3.5 吡啶用量與溫度對DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖6 為吡啶用量和溫度對改性產物DPPH 自由基抑制率的響應曲面和等高線圖。當時間與液料比為最佳值時，隨著吡啶用量以及溫度的增加，改性產物DPPH 自由基抑制率均先增大后減小。由圖6 可以確定最佳水平范圍溫度為57.5～65 ℃，催化劑用量為0.27～0.36 g。

3.2.3.6 溫度和時間對DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖7 為時間和溫度對DPPH 自由基抑制率影響的響應曲面和等高線圖。當吡啶用量與液料比為最佳值時，隨著溫度的升高、時間的延長，改性產物DPPH 自由基抑制率均先變大后減少。由圖可以確定最佳水平范圍溫度為57.5～64.8 ℃，時間為1.62～2.37 h。

圖6 吡啶用量和溫度對DPPH 自由基抑制率響應曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.6 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of pyridine dosage and reaction temperature on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

圖7 溫度和時間對DPPH 自由基抑制率響應曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.7 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of reaction temperature and time on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.4 最優條件及驗證實驗

通過軟件對數據進一步分析可得模型理論最佳條件為液料比8.31、催化劑用量0.32 g、在61.5 ℃下回流反應2.03 h，模型預測改性茶多酚DPPH 自由基抑制率為0.9376。按最優條件進行實驗驗證，所得改性茶多酚DPPH 自由基抑制率為0.9318，相對誤差為-0.64%，說明此模型預測可靠。

3.3 茶多酚乙酰化性能比較

圖8 改性茶多酚與幾種抗氧化劑性能比較Fig.8 Comparison of DPPH·scavenging rates，fat protection index and light transmittance among modified tea polyphenol and other antioxidants

丁基羥基茴香醚(BHA)與特丁基對苯二酚(TBHQ)是兩種常見的抗氧化劑。茶多酚乙酰化改性產物與這兩種常見抗氧化劑性能比較見圖8。從圖中可以看出，與未改性茶多酚相比，改性茶多酚的抗氧化能力得到了較大的提高。DPPH 自由基清除率從0.1220 提高到0.9318，比改性前提高了7.64倍;脂溶性也大大提高，透光率從0.225 提高到0.926，溶解性比改性前提高了4.12 倍;而衡量油脂抗氧化能力的保護系數從2.300 提高到6.612，提高了2.87 倍。乙酰化后的改性茶多酚抗氧化能力優于BHA 以及TBHQ 這兩種常見抗氧化劑，DPPH 自由基清除率是特丁基對苯二酚的1.1 倍，保護系數是特丁基對苯二酚的2.48 倍。

4 結論

本文采用乙酸酐對茶多酚進行改性，從四個因素(液料比、吡啶用量、反應時間、反應溫度)考察了改性產品對DPPH 自由基抑制率的影響。利用響應面法設計正交實驗，建立了四因素相互作用的回歸模型，預測最佳乙酰化條件為料液比1∶8.31、催化劑用量0.32 g、反應溫度61.5 ℃、反應時間2.03 h，實驗所得改性茶多酚DPPH 自由基抑制率為0.9318，與模型預測值非常接近，比改性前提高了7.64 倍。此條件下產物脂溶性良好，透光率為0.926，與未改性產品相比，溶解性提高了4.12 倍。抗氧化性能實驗顯示改性產物的抗氧化能力優于BHA 和TBHQ 這兩種常見抗氧化劑。

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