UPLC-TOF-MS 快速測定不同核用銀杏品種銀杏葉中銀杏內酯和白果內酯含量

張 崢，葉小玉，肖 強，周大寨

生物資源保護與利用湖北省重點實驗室 湖北民族學院，恩施 445000

銀杏(Ginkgo biloba L.)是我國特產的銀杏科銀杏屬的孑遺植物［1］。銀杏葉提取物(簡稱GBE)及其制劑具有擴張冠狀動脈血管、增強心肌收縮力、增加腦血流量、改善腦營養、保護神經元等多種生物活性［2，3］;已被用于治療腦損傷后遺癥、老年性癡呆、衰老、神經性疾病、帕金森病及老年性心血管系統機能衰退等癥。現代藥理學研究表明，銀杏主要有效成分為黃酮甙和銀杏內酯類化合物;目前為止發現銀杏萜內酯8 個，分別是銀杏內酯(A、B、C、J、K、L、M)和白果內酯(bilobalide)［4，5］，其中以銀杏內酯A、B、C(簡稱GA、GB、GC)和白果內酯(bibobalide，簡稱BB)為主，它們具有特異性的抗血小板活化因子(PAF)活性［3］。由于GBE 產品中銀杏內酯的含量通常很低，常用的高效液相色譜檢測器(如紫外檢測器)靈敏度不夠，本底高且受其它雜質干擾不能適用［5，6］;示差折光檢測器，一方面靈敏度比紫外檢測器還差，另一方面則由于分離內酯時通常采用的梯度洗脫會產生基線漂移，容易造成定量不準［4，7］，蒸發激光散射檢測器(ELSD)靈敏度高，選擇性好，但其響應是非線性，帶來定量誤差［8］，難以用于質量控制中的定量分析。高效液相色譜(HPLC)與質譜(MS)聯用技術結合了HPLC 分離和MS 定性的優勢，TOF-MS 可以提供相對分子質量的高精度信息，本文通過超高壓液相-飛行時間質譜聯用(UPLC-TOF-MS)技術對銀杏內酯進行質譜分析，采用其獨特的選擇離子流提取方式，提高了分析靈敏度，可在極短時間內實現對銀杏內酯的快速定性和定量測定，滿足分析需要。

1 材料與儀器

1.1 材料

2012 年6 月對鄂西南各縣市銀杏品種母樹(經恩施州林業科學研究所吳代坤高級工程師鑒定)采集銀杏葉，銀杏葉置烘箱及時烘干粉碎，過40 目篩備用。

1.2 儀器、藥品與試劑

Agilent 1290 液相色譜和飛行時間質譜儀(6224型)配有電噴霧電離(ESI)源和大氣壓化學電離源(APCI);采用Agilent Masshunter 工作站和數據處理軟件對信號進行采集和數據處理。

銀杏內酯樣品:銀杏內酯A(GA)、銀杏內酯B(GB)、銀杏內酯C(GC)、白果內酯(BB)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110862-201009、110863-200508、110864-200906、110865- 200605;甲酸(色譜純)、乙腈(色譜純):迪馬科技有限公司產品;實驗用水為超純水(Milipore，Bedford，MA，USA)。

2 實驗方法

2.1 色譜分析條件

Agilent ZORBAX C18(2.1×50 mm，1.8 μm)色譜柱。流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序如下:0～5 min，20%～45%乙腈，柱溫25 ℃，流速0.2 mL/min。

2.2 質譜分析條件

ESI 離子源負模式，干燥氣溫度350 ℃，流速10 L/min;霧化器壓力45 psig，毛細管電壓3500 V，毛細管出口電壓150 V，錐孔電壓65 V，采集速度1.5 spectra/s，選擇離子(EIC)采集模式，選定分子離子［M-H］-的質荷比分別為407.15(GA)，423.15(GB)，439.12(GC)，325.11(BB)。

2.3 混合標準溶液的配制

精密稱取對照品GA 1.052 mg、GB 1.294 mg、GC 1.009 mg、BB1.055 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，振搖使溶解，得銀杏內酯對照品儲備液。取BB 1 mL，GA、GB、GC 各200 μL，用甲醇定容至10 mL 制成混合對照品溶液。實際使用時再用甲醇適當稀釋。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系

將上述對照品溶液分別稀釋1.0、2.5、3.3、4.0、5.0 倍，按所設LC-MS 條件進樣10 μL，測定進樣量與相應質譜峰面積的關系。以內酯的選擇性離子流色譜圖(見圖1)中峰面積為縱坐標，相應的內酯質量濃度為橫坐標，對測定結果進行直線回歸，求得GA、GB、GC、BB 的線性方程及相關系數，在0.2～4 μg/mL 范圍內，4 種銀杏內酯的線性關系如下:GA:Y=67940X-28506，R2=0.9999;GB:Y=2000000X+23738，R2=0.9996;GC:Y=2000000X+67415，R2=0.9996;BB:Y=57562X-9073，R2=0.9999。

圖1 GA、GB、GC、BB 的選擇離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms(EIC)of GA，GB，GC and BB

2.4.2 精密度與準確性

按前述LC-MS 條件對同一混合標樣重復測定4次，4 種內酯的相對標準偏差RSD 分別為GA:1.53%，GB:1.65%，GC:1.52%，BB:1.26%，說明本方法較為準確、可靠。

2.4.3 重復性

取銀杏葉樣品5 份，按照2.5 項下方法制備供試樣品溶液，連續進樣5 次，記錄色譜圖。結果表明4 種內酯的相對標準偏差RSD 均小于3.8%，符合定量分析要求，表明方法的重復性良好。

2.5 樣品制備

精確稱取銀杏葉樣品2.0 g，加入50%乙醇溶液置于索氏提取器中70 ℃提取2 h，冷卻抽濾，濾渣加入50%乙醇溶液再次提取2 h;合并兩次得到的提取液旋轉蒸發至干，然后加10 mL 蒸餾水及0.3 g乙酸鈉溶解，加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相旋轉蒸發至干，用甲醇溶解并定容至10 mL。

3 結果與分析

用前述方法對鄂西南不同銀杏品種葉片的4 種內酯進行了測定，經回歸方程計算各種內酯的含量，由表1 可見，不同品種間白果內酯含量差異具有極顯著性，其中以恩銀23 號含量最高，較含量最低的恩銀1 號高出1 倍以上;4 種內酯總含量在各品種間差異極顯著，其中，恩銀23 號總內酯含量在四個品種最高;而恩銀2 號則最低。

表1 不同銀杏品種葉片白果內酯和銀杏內酯含量(n=3，±s)Table 1 The contents of bibobalides and gingkolides in the leaves of G.biloba from different species(n=3，±s)

表1 不同銀杏品種葉片白果內酯和銀杏內酯含量(n=3，±s)Table 1 The contents of bibobalides and gingkolides in the leaves of G.biloba from different species(n=3，±s)

注:同一欄內數據后不同字母者在0.05 水平上差異顯著。Note:Values followed by a different letter were of significant difference at the 0.05 probability level.

4 討論

由于各種銀杏內酯的結構很相似，且無特征紫外吸收，雖然在210 nm 處有紫外吸收，但此波長與洗脫溶劑甲醇或乙腈紫外吸收截止波長非常接近，容易造成紫外檢測背景值偏高。另外，一般情況下所測樣品中銀杏內酯的含量非常低，對于靈敏度不高的檢測器，如紫外、示差等，樣品需反復多次提取、純化、濃縮，以提高銀杏內酯的濃度，才能進行檢測，如此眾多的環節往往帶來較大的檢測誤差。基于其它檢測器存在的缺陷。作者采用飛行時間質譜儀作為檢測器，用液-質聯用儀進行定量分析。由于它靈敏度很高，0.2 μg/mL 銀杏內酯即可產生足夠的質譜信號，解決了靈敏度問題，且具有較好準確性好;另一方面，紫外等檢測器對于性質相近GA、GB 出現的共流出無能為力，不能進行準確定量;從圖1 可見，在選定分離條件下，GA 和GB 存在共流出，但質譜儀通過EIC 功能可以準確定量共流出峰不同離子，從而做到同時準確定量4 種主要銀杏內酯。

液-質聯用儀的質譜采用軟電離方式，即電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學電離(APCI)，在它的總離子流質量色譜圖上能得到較強的分子離子峰(［M+H］+或［M-H］+，M 代表相對分子質量);根據銀杏內酯的結構中含有很多氧原子及活潑羥基，故選擇ESI 負離子采集方式。用自動進樣器直接進樣，調節各參數，以得到最強的分子離子峰(［M-H］+)，確定最佳實驗條件;同時采用質譜的EIC 選擇離子流提取方式提取色譜圖，即選定407.15(MGA-1)、423.15(MGB-1)、439.12(MGC-1)、325.11(MBB-1)4 個相對分子質量進行色譜提取，進一步提高了銀杏內酯的檢出靈敏度。

作者采用近年來迅速發展的UPLC-MS 方法，利用超高壓液相色譜實現微量樣品的迅速分離，本方法在4 分鐘內即完成了四種主要銀杏內酯的分離，較其它液質聯用方法［9］相比，大大節約了洗脫溶劑的消耗，節省了寶貴的時間;采用TOF-MS 作為檢測器，發揮其靈敏度高、精密度與準確性好的優點，實現了短時間內對樣品中微量銀杏內酯的定量檢測。基于上述方法，利用自動進樣器可以實現對大量樣品的快速準確定量。

目前國際上一般公認的銀杏葉制品質量指標為1991 年德國Schwabe 制藥廠生產的產品EGb761 標準，即黃酮苷24%以上，內酯6%以上，銀杏酸10 mg/kg 以下。其中，3 種苷元的大體比例是3∶2.6∶1。內酯中白果內酯與萜內酯的含量大致相等，而萜內酯A、B、C 的比例約為2∶2∶1［10］。本研究表明，在恩銀23 號葉片中，4 種內酯含量在4 個品種中最高，同時白果內酯和萜內酯的含量之比約為1.5:1，且萜內酯A、B、C 的比例接近1.5∶1.5∶1，適合作為葉用銀杏品種開發的優選品種。

1 Shi QW(史清文)，Liu SY(劉素云)，Zhang WS(張文素)，et al.The survey of the research and development of the leaves of Ginkgo biloba L.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，1995，7:70-76.

2 Wang H(王輝).Study on chiefly active components of natural Ginkgo biloba.Beijing:Beijing university of chemical technology(北京化工大學)，MSc.2007.

3 Braquer P.The gingkolides:potent platelet activiting factor antagonists isolated from ginkgo biloba L.Chemistry，pharmacology and clinical applicat ions.Drug of Future，1987，12:643-699.

4 Fan WG(樊衛國)，Liu JP(劉進平)，He J(何俊)，et al.Studies on seasonal variation of flavonoids，ginkgolides and the optimum harvest time on leaves of ginkgo.J Mount Agric Biol(山地農業生物學報)，2000，19:117-120.

5 Shao SR(邵勝榮).Study on the technique of extraction，purification，preparation and quality control of the bio-active constituents from Ginkgo biloba.Hangzhou:Zhejiang University(浙江大學)，MSc.2005.

6 Meng C(孟超)，Xu H(徐弘)，Cheng KD(程克棣).Pre-liminary study on the ginkgolide B and bilobalide contents in different tissues and callus cultures of Ginkgo biloba.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2005，17:603-605.

7 Zhang J(張鑒)，Pan J(潘見)，Xie HM(謝惠明)，et al.Determination of five kinds of gingkolides in Gingko biloba leaves extract by reversed-phase high performance liquid chromatography.J Anal Chem(分析化學)，2000，28:53-56.

8 Lv FS(呂伏生)，Chen W(陳偉)，Feng F(馮芳)，et al.The contents of terpenelactones in the ginkgo injection.J Chin Pharm Univ(中國藥科大學學報)，2001，32:34-36.

9 Qin F(秦昉)，Tao GJ(陶冠軍)，Wang LX(王林祥).Determination of low-level gingkolides by LC-MS.J Wuxi Univ Light Ind(無錫輕工大學學報)，2003，22(4):80-82.

10 Ma MD(馬明東)，Pu SR(蒲尚饒).Ginkgo biloba extract(GBE)quality indicators and influencing factors.J Sichuan Forest Sci Technol(四川林業科技)，2000，21:25-28.