UPLC-MS 同時測定赤芍中五個指標成分的含量

胡 杰，李月婷，侯靖宇，王愛民，黃 勇*

1 貴陽醫學院藥學院 貴州省藥物制劑重點實驗室;2 貴陽醫學院 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴陽 550004

赤芍為毛茛科植物芍藥(Paeoniae lactiflora Pall.)或川赤芍(Paeoniae veitchii Lynch)的干燥根［1］。其味苦、微寒、歸肝經，具有清熱涼血、散瘀止痛之功效，是中藥中具有代表性的活血化瘀藥物，在臨床上應用廣泛。現代藥理研究發現，赤芍具有多方面的作用，如抗血栓形成、抗血小板聚集、抗菌、抗炎、抗病毒等［2］。鑒于赤芍藥效作用廣泛、成分多樣，宜選用多指標成分測定的方法，較為全面、綜合地反映和控制赤芍的質量［3-5］。文獻報道，赤芍的主要有效部位為芍藥總苷，其中包括芍藥內酯苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等［6］。本實驗采用UPLC-MS 聯用技術對12 批不同產地赤芍藥材中芍藥內酯苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和沒食子酸5 種指標成分進行含量測定，為赤芍藥材的質量控制提供參考依據［7］。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

ACQUITY 系統超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀，包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、三重四級桿質量分析器和Masslynx4.1 質譜工作站(美國waters 公司)。

1.2 實驗材料

沒食子酸(1)和葛根素(6)對照品(均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110831-200803、0752-9605，純度≥98%);氧化芍藥苷(2)、芍藥內酯苷(3)、芍藥苷(4)、苯甲酰芍藥苷(5)對照品(均購自中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，批號分別為Y10-130912、S37-100126、110736–200934、B14-130912，純度≥98%);乙腈、甲酸為色譜純，甲醇為分析純。

赤芍藥材來源見表1，由貴陽醫學院藥學院藥用植物學與生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為毛茛科植物芍藥(P.lactiflora Pall.)或川赤芍(P.veitchii Lynch)的干燥根。

表1 赤芍藥材來源表Table 1 Source of Radix Paeoniae Rubra

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm);流動相0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～3.0 min，5%～25%A;3.1～4.0 min，25%～90%A;4.1～5.0 min，90%～5%A);流速0.35 mL/min;柱溫45 ℃;進樣量1 μL;分析時間為5 min。

2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，毛細管電壓3 KV，離子源溫度120 ℃，去溶劑氣(氮氣)650 L/h，去溶劑氣溫度350 ℃，碰撞氣(氬氣)0.18 mL/min;選擇性離子監測(SIR)模式進行正負離子同步監測;沒食子酸等六種成分用于定量分析的監測離子見表2。

表2 質譜分析條件Table 2 MS analysis condition

2.3 溶液配制

2.3.1 對照品溶液

分別精密稱取1～5 對照品10 mg，各置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得1 mg/mL的1～5 對照品儲備液;精密稱取內標6 對照品10 mg，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，從10 mL 容量瓶中吸取2 mL 溶液置于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，制得0.02 mg/mL 的6 對照品儲備液。

2.3.2 供試品溶液

精密稱取供試品約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，浸泡4 h，超聲30 min，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，離心(15000 g)10 min，取上清液進樣。

2.4 專屬性試驗

分別精密稱取1～6 對照品適量，制成1～6 濃度分別為20.0、20.5、20.1、21.4、20.2 和20 μg/mL的混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液和赤芍藥材溶液各1 μL，分別進樣，結果見圖1。供試品溶液中被測定化合物與6 個對照品的保留時間相同。比較被測定成分和對照品的質譜圖，兩者一致，表明本法專屬性良好。

2.5 線性試驗

分別取“2.3”項下1～5 對照品儲備液適量，制成1～5 濃度分別為31.25、2.78、30.75、75.04、40.36 μg/mL 的混合對照品溶液。依次逐級稀釋，再分別加如一定量的20 μg/mL 的葛根素內標，制得6個濃度的系列濃度線性工作液，分別進樣測定。以對照品濃度c(X)為橫坐標，色譜峰面積與內標峰面積比值As/Ai(Y)為縱坐標，進行線性回歸。回歸方程、定量限(LOQ)和檢測限(LOD)等結果見表3。

圖1 混合對照品溶液(A)和供試品溶液(B)的UPLC-MS 選擇離子色譜圖Fig.1 UPLC-MS selected ion chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

表3 5 種成分的線性關系Table 3 Linear relationships of the 5 investigated compounds

2.6 重復性試驗

取同批赤芍藥材，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣測定，計算1～5 含量的RSD 分別為4.60%、3.71%、4.32%、4.05% 和4.45%，表明本方法重復性良好。

2.7 精密度試驗

同批的供試品溶液，連續測定3 d，每天進樣6次，測定峰面積并計算含量，結果1～5 的日內和日間RSD(%，n=6)分別為4.80%、4.67%、3.27%、4.37%和2.84%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于處理后0、2、4、8、12 h 進樣分析，1～5 含量的RSD 分別為4.20%、3.83%、4.03%、4.17%和2.61%，表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.9 回收率試驗

精密稱取9 份已知含量的赤芍樣品適量，平均分為3 組，分別精密吸取125、250 和375 μL 的混合標準溶液(1～5 濃度分別為5.00、1.28、7.53、18.76和2.52 μg/mL)樣品測定，制成低、中、高濃度的質控樣品，室溫揮干，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，結果見表4。

2.10 樣品測定

按“2.3”項下方法制備12 批樣品的供試品溶液，分別進樣測定，計算得樣品中1～5 的含量，結果見表5。

除Y3 和Y4 外，其余批次的藥材皆符合《中國藥典》對赤芍藥材的質量要求1。12 批藥材里，Y6中芍藥苷的含量最高，但五個有效成分綜合含量最高的是Y9。

表4 回收率試驗結果(%，n=3)Table 4 Testing results of recovery(%，n=3)

表5 12 批赤芍藥材中5 個成分的含量(%，n=3)Table 5 Determination of 5 compounds from 12 batches of Radix Paeoniae Rubra samples(%，n=3)

3 討論

目前，大多機構遵循《中國藥典》，通過測定中藥中某一有效成分的含量來評價該藥材的優劣［1，8］。但中藥作為一種多療效多靶點的復雜天然藥物，單一成分的含量并不能體現其真實藥效，因此，對中藥有效部位中包含的各成分綜合測定，能夠實現對該中藥質量較全面地評價［6，9］。

本實驗采用UPLC-MS 聯用技術，將UPLC 對中藥復雜成分的高分離度與MS 的高靈敏度、高選擇性以及能夠提供相對分子量與結構信息的優點結合起來，建立了應用UPLC-MS 同時測定赤芍藥材中5個指標成分的方法［10］。該方法具有專屬性強、靈敏度高、穩定性好的優點，并且分析速度快，僅5 min就能夠完成檢測工作，較大地提高了分析效率，為中藥復雜樣品檢測分析、質量控制提供了一種更高效的方法［11］。

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