NIRS 結(jié)合TQ 軟件快速測定山茱萸中莫諾苷的含量

龔海燕，李 珊，謝彩俠，雷敬衛(wèi)，陳志紅，段小彥，白 雁*

1 河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州 450048;2 鄭州市食品藥品檢驗所，鄭州 450007

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)的干燥果肉。有補益肝腎，固澀精氣的功效［1］，藥理研究表明它具有免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、抗菌、抗炎等作用［2］。山茱萸是常見中成藥如六味地黃丸、金匱腎氣丸等的主要原料，其質(zhì)量直接影響這些藥物的療效和安全性。研究表明，其化學(xué)成分主要含有環(huán)烯醚萜苷、有機酸等［3］。近代研究表明環(huán)烯醚萜苷類為山茱萸中主要有效部位［4］，而莫諾苷屬環(huán)烯醚萜苷類，為山茱萸中主要藥效成分，具有苦補健胃和預(yù)防糖尿病性血管病的作用［5］。2010 版《中國藥典》一部中只對山茱萸藥材中馬錢苷成分進行了定量分析，然而馬錢苷只是山茱萸中的主要有效成分之一。且有研究表明馬錢苷與莫諾苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，在炮制工藝中，二者可能有相互間結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，致使含量升高［6］。所以只測定馬錢苷的含量是不能代表山茱萸藥材的質(zhì)量的，因此為了更好地控制山茱萸藥材的質(zhì)量，有必要建立測定莫諾苷的含量的快速方法。

近紅外光譜(NIRS)分析技術(shù)樣品前處理簡單、無損、無污染，具有傳統(tǒng)分析方法所不具有的優(yōu)點，近年來廣泛用于中藥材定性判別和定量分析等方面［7，8］。研究表明偏最小二乘法適合中藥復(fù)雜樣品，特別是粉末樣品的定量模型的建立［9，10］。本實驗采用近紅外光譜法與偏最小二乘法相結(jié)合的方法建立了快速測定山茱萸中莫諾苷的定量分析模型，為大批量山茱萸藥材中莫諾苷的快速測定提供了一種新的綠色測定方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Thermo Nicolet 6700 型傅立葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet 公司)，配有InGaAs 檢測器、外接積分球、樣品旋轉(zhuǎn)器、OMNIC 光譜采集軟件和TQ8.0 分析軟件;Waters2695 高效液相色譜儀(PDA 2996 紫外檢測器);FW-200 型高速藥材粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);CS101-2D 電熱鼓風(fēng)干燥箱;MTTTLER TOLEDO XP205 十萬分之一天平。

1.2 試劑

乙腈、甲醇為色譜純，水為樂百氏純凈水。莫諾苷對照品(由成都曼斯特生物科技有限公司提供，純度＞98%)，95 份山茱萸藥材分別來自河南西峽、浙江、陜西，由河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)。

2 方法與結(jié)果

2.1 近紅外光譜的采集

將山茱萸的干燥樣品粉碎，過80 目篩，制成粉末樣品，每份粉末樣品取約4 g，放入石英樣品杯中，攤平后以空氣為參比，扣除背景，采集近紅外光譜圖。采集方式:積分球漫反射;掃描區(qū)間:4000～12000 cm-1;分辨率:8 cm-1;掃描次數(shù):32 次;溫度(25±2)℃，相對濕度30%～40%。每個樣品掃描三次，取平均值作為樣品NIR 光譜圖。圖1 是95 份山茱萸樣品的近紅外光譜疊加圖。

圖1 95 份山茱萸樣品的近紅外光譜的疊加圖Fig.1 NIR spectra of 95 Fructus Corni samples

2.2 山茱萸中莫諾苷的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取莫諾苷對照品適量，加80%的甲醇制成濃度為151.40 μg/mL 的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末約0.1 g，精密稱定，加入具塞錐形瓶中，精密加入80%的甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件及測定方法

大連依利特Hypersil ODS C18色譜柱;流動相為乙腈-水(11∶89)，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為240 nm。進樣體積10 μL，以保留時間定性，峰面積定量，外標(biāo)法計算。每份樣品平行做2次，以其平均值作為HPLC 參考值。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密量取標(biāo)莫諾苷準(zhǔn)液0.5、1.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，按2.2.3 項下條件，精密吸取10 μL 分別注入高效液相色譜儀，以峰面積積分值y 為縱坐標(biāo)，莫諾苷的含量x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，莫諾苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=1.2E+6x-9100.3，R2=0.9998，在7.57～151.40 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度考察

精密量取151.40 μg/mL 的莫諾苷對照品溶液10 μL，進樣6 次，測定峰面積，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.56%，說明該方法精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性考察

取同一樣品，稱取6 份，各0.1 g，精密稱定，各按2.2.2 項下的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL 進樣，測定莫諾苷的含量，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值為1.56%。由此可見，采用本方法測定莫諾苷含量，重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實驗

取同一樣品0.1006 g，按照2.2.2 項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別在0、2、4、8、12 h 進樣，其莫諾苷的峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%，結(jié)果表明莫諾苷在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量(1.35%)的山茱萸約0.1 g，共6 份，分別精密稱量對照品(1.35 mg)，按照

2.2.2 項下方法制備供試品溶液，測定其含量，計算回收率，得平均回收率為98.56%，RSD 為1.03%。

3 山茱萸藥材中莫諾苷定量模型的建立

對于復(fù)雜的天然產(chǎn)物的近紅外定量模型的建立，通常采用偏最小二乘法(PLS)。本實驗采用PLS 建立定量分析模型，并選擇不同的預(yù)處理方法和不同的譜段，主因子數(shù)來建立定量校正模型。建模過程中常使用R2、RMSECV、RMSEC、RMSEP 為評價模型性能優(yōu)良的參數(shù)，其中，R2指校正集樣品由NIR 分析模型得到的預(yù)測值和參考值之間的相關(guān)性，R2越接近于1，表示分析模型對校正集預(yù)測越準(zhǔn)確。RMSEC 指校正集樣品由NIR 分析模型得到的預(yù)測值和參考值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差，RMSEC 值越小，說明所建模型對校正集預(yù)測效果越好［4］。RMSECV指模型通過內(nèi)部交叉驗證得到的校正標(biāo)準(zhǔn)偏差，體現(xiàn)模型的整體性能，RMSECV 值越小，校正集樣品的預(yù)測結(jié)果越接近參考值。RMSEP 指驗證集樣品的NIR 預(yù)測值與參考值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差，RMSEP 值越小，驗證集樣品的預(yù)測結(jié)果越接近參考值。

3.1 山茱萸樣品的選擇

從收集到的的95 份樣品中，根據(jù)其莫諾苷含量分布，選取78 個有代表性的樣品組成校正集，剩余17 個樣品為驗證集。如表1 列出了校正集和驗證集樣品莫諾苷含量分布范圍及其統(tǒng)計結(jié)果。

表1 校正集與驗證集中莫諾苷的含量分布Table 1 Content distribution of calibration and validation set for morroniside

3.2 光譜的預(yù)處理

原始NIR 圖譜(圖1)可以看出，樣品的平均近紅外光譜極為相似，難以直接找出特征吸收帶將其區(qū)分。此外，近紅外光譜圖有明顯的散射漂移，且光譜信號易受樣品粒度大小、密實度、噪音及光散射等因素影響。為了有效的消除各種噪音及測量誤差對分析造成干擾，進而突顯光譜中有用信息，研究中首先將原始圖譜進行預(yù)處理。

由表2 以看出采用二階導(dǎo)數(shù)(SD)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換標(biāo)量(SNV)+卷積平滑(SG)處理的光譜所建立的PLS 定量分析模型的R2為0.9845，為所建模型中最高，RMSEC、RMSECV 和RMSEP 分別為0.109、0.2641 和0.233，均為所建模型中最低，說明模型的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、擬合度和預(yù)測能力均相對較好，因此選定該光譜預(yù)處理條件為最佳條件。

表2 不同光譜預(yù)處理方法對建模的影響Table 2 The effects of different preprocessing methods on model development

3.3 建模譜段的選擇

由于樣品近紅外光譜譜峰重疊嚴(yán)重，用常規(guī)的線性分析方法無法分析。但經(jīng)由二階導(dǎo)數(shù)處理后，其吸收峰會變得尖銳，有效信息譜段更加明顯。由表3 比較結(jié)果可以看出最佳建模波段為4011.21～8000.00 cm-1。圖3 為樣品在上述處理條件下的近紅外光譜的二階導(dǎo)數(shù)圖譜。

表3 建模波段對模型的影響Table 3 The effect of model performance by different regions

3 山茱萸樣品在前處理后的近紅外光譜的二階導(dǎo)數(shù)圖譜Fig.3 The second derivative spectrum of Fructus Corni samples

3.4 建模主成分的選擇

主成分的選擇直接關(guān)系到PLS 定量分析模型的實際預(yù)測能力。主因子數(shù)過少，會導(dǎo)致建模信息不全;主因子數(shù)過多會導(dǎo)致模型過擬合，這均會降低模型的預(yù)測能力。本實驗用交互驗證法，考察主因子數(shù)對RMSECV 的影響，選擇最適主因子數(shù)。根據(jù)校正集RMSECV 與主成分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)圖，如圖4所示，當(dāng)RMSECV 值最小為0.2738，所選主成分?jǐn)?shù)最佳為10。

圖4 校正集RMSECV 與主成分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)圖Fig.4 Correlation plot of RMSECV values and different principal components

3.5 莫諾苷模型的建立

采用以上確定的最優(yōu)條件，即PLS+SNV+二階導(dǎo)數(shù)法光譜前處理方法，建模范圍4011.21～8000.00 cm-1，選擇10 個主成分建立最優(yōu)校正模型。所建模型的校正集相關(guān)系數(shù)R2為0.9857，校正均方差RMSEC 為0.105，預(yù)測均方根偏差為0.234，其結(jié)果如圖5、6 所示。

圖5 校正集預(yù)測值與參考值之間的相關(guān)圖Fig.5 Correlation between NIR predicted values and reference values

圖6 預(yù)測絕對誤差與參考值相關(guān)圖Fig.6 Deviation between NIR predicted values and reference values

3.6 莫諾苷定量模型的驗證

將17 份驗證集樣品的NIR 圖譜輸入定量分析模型，預(yù)測其莫諾苷含量，并與高效液相色譜法測得值進行比較，結(jié)果見表4。

表4 NIR 預(yù)測值與高效液相色譜值的比較Table 4 Comparison of NIR predicted and conference values

由表4 知，最大絕對偏差0.42%，以驗證集樣品的NIR 預(yù)測值與HPLC 測定值的比值作為預(yù)測回收率，所得平均回收率102.36%，結(jié)果表明，利用近紅外光譜技術(shù)測定山茱萸中莫諾苷的含量是可行的。

3.7 統(tǒng)計學(xué)分析

將17 個驗證集樣品NIR 預(yù)測值與高效液相色譜法所測得的分析值進行配對t 檢驗，結(jié)果顯示t=-0.591，雙側(cè)P=0.563＞0.05，按α=0.05 水準(zhǔn)不拒絕H0，即說明兩種方法的分析結(jié)果差別無統(tǒng)計學(xué)意義，表明該模型可用于預(yù)測其覆蓋范圍內(nèi)的山茱萸中莫諾苷含量。

4 結(jié)論

在用高效液相色譜法測量山茱萸中莫諾苷時，選擇流動相的時候，參考藥典，以乙腈和水為流動相，來摸索其比例過程中發(fā)現(xiàn)，乙腈的比例越大，莫諾苷的保留時間越小，但不能完全分離，從乙腈:水=19∶81 開始，逐漸降低乙腈的比例，直到11∶89 才能將其完全分開，分離效果較好，因此選擇該比例為最佳流動相條件。

中藥材生長的環(huán)境不同，致使其內(nèi)在成分有所差異，有效成分含量亦不相同，本研究能夠為中藥山茱萸的質(zhì)量控制研究提供一種有效的研究途徑和思路。通過NIRS 光譜法與化學(xué)計量學(xué)技術(shù)相結(jié)合，采用了偏最小二乘法，通過比較選擇了最佳的近紅外光譜的前處理方法、建模譜段和主因子數(shù)，建立了山茱萸中莫諾苷含量的定量校正模型，模型的預(yù)測能力較好。結(jié)果表明該方法快速、準(zhǔn)確、無損、無污染，為制藥企業(yè)山茱萸藥材中莫諾苷快速分析提供了一種快速和綠色方法。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，26.

2 Dai JZ(戴建子)，Zhang ZH(張志豪)，Tang L(唐蕾)，et al.Advance on chemical compositions and pharmacology of Cornus officinalis.China Pharm(中國藥業(yè))，2006，15(2):74-78.

3 Zhang YE，Liu EH，Li HJ，et al.Chemical constituents from the fruit of Cornus officinalis.Chin J Nat Med(中國天然藥物)，2009，7:365-370.

4 Cao G，Zhang Y，Cong XD，et al.Research progress on the chemical constituents and pharmacological activities of Fructus Corni.J Chin Pharm Sci，2009，18:208-212.

5 Liu H(劉洪)，Xu HQ(許惠琴).Advance in research of Fructus Corni officinalis and its main compositions.J Nanjing TCM Univ，2003，19:254-257.

6 Zhang ZL(張振凌)，Zhao JY(趙建穎)，Li J(李娟)，et al.Function of getting rid of cores of Cornus officinalis Sieb.Et Zucc.and studies on method of processing in producing area.J Chin Med，2006，29:60-63.

7 Bai Y(白雁)，Li S(李珊)，Wang X(王星)，et al.Determination of chlorogenic acid of honeysuckle by near-infrared spectroscopy rapidly.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學(xué)雜志)，2011，17(5):66-70.

8 Gong HY(龔海燕)，Song RL(宋瑞麗)，Bai Y(白雁)，et al.The discrimination of Tiegun Yan using NIR combine conformity test.Comp App Chem(計算機與應(yīng)用化學(xué))，2010，27:967-970.

9 Li R(李睿)，F(xiàn)an XL(樊夏雷)，Zhou XH(周小華)，et al.Identification of Aristolochia manshuriensis，Clematis armandi and Akebia trifoliate by near infrared diffuse reflectance spectra.Chin J Pharm(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2011，42:933-937.

10 Bai Y，Zhang W，Xie CX，et al.Fast determination of active components in Scutellaria extract by NIRS combined with PLS.2012 International Conference on Biomedical Engineering and Biotechnology，1034-1038.