深紅酵母JLC 固態發酵廢棄煙梗制備類胡蘿卜素研究

郭大城，張可可，董貴彬，張旭萍，劉 慧，朱大恒，席 宇*

1 河南省疾病預防與控制中心，鄭州 450016;2鄭州大學生命科學學院，鄭州 450001

類胡蘿卜素(carotenoids)是萜類化合物的羥基化衍生物，在生物體內具有抗炎、增強機體免疫力、防治腫瘤和治療光敏性疾病等作用［1］，因此在食品、化妝品、醫藥和飼料添加劑等行業有廣泛的應用［2-4］。利用非糧廉價底物通過微生物的合成作用生產類胡蘿卜素，降低生產成本是目前類胡蘿卜素生產的一個研究熱點［5］。煙梗是卷煙工業的一種廢棄物，約占煙葉總重的20%～30%［6］，大量的煙梗被廢棄，造成資源浪費和環境污染［7，8］。煙梗中含有大量的可溶性糖類和氮類物質［9］，因此對其進行資源化利用是非常重要的。目前WTS 多用來提取煙堿、果膠、茄尼醇［10-12］，然而利用酵母發酵WTS生產類胡蘿卜素尚未見報道。本實驗以一株分離的富含類胡蘿卜素的深紅酵母(Rhodotorula rubra)JLC為出發菌株，以WTS 為主要基質，對影響菌株JLC發酵生產類胡蘿卜素的因素利用PB 設計法進行考察，旨在為WTS 的資源化利用和天然類胡蘿卜素的開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

WTS 由河南天昌國際煙草有限公司提供，長度為0.2～5.0 cm，直徑為0.15～0.50 cm。酵母粉和蛋白胨購自英國OXOID 公司，瓊脂粉購自美國Sanland 公司，其余實驗用試劑均為國產分析純。

1.2 菌株及培養基

深紅酵母JLC 保藏于鄭州大學生命科學學院，其類胡蘿卜素最大吸收波長485 nm。菌種保藏和種子液制備均采用煙梗提取液(tobacco stem extraction，TSE)培養基［13］，其中固體培養基瓊脂含量為2.0%。

1.3 儀器

生化培養箱(MJX-70，上海和呈儀器制造有限公司);電熱鼓風干燥箱(101，北京中興偉業儀器有限公司);立式高壓滅菌器(YXQ-LS-30SII，上海博迅實業有限公司);雙人雙面凈化工作臺(SW-CJ-2F，蘇州凈化設備有限公司);紫外可見分光光度計(UV-2450，日本島津);低溫高速離心機(Avanti J-25，Beckman coulter);連續流動分析儀(AA3，德國布朗盧比公司);恒溫數顯水浴鍋(XTMD-8222，上海精宏實驗設備有限公司);電子分析天平(BS223S，北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 煙梗預處理及成分分析

WTS 于60 ℃干燥箱中干燥2 h，去除較粗和較長煙梗后過16 目標準篩除塵備用。處理后WTS 采用連續流動分析儀進行主要成分分析。

1.4.2 種子液制備

從菌種斜面挑取一環培養物接種到含有80 mL種子培養液的250 mL 三角瓶中，置于恒溫搖床30℃和180 rpm 條件下培養36 h，獲得的培養物作為固態發酵的種子液。

1.4.3 固態發酵方法

分別稱取一定量的WTS 置于250 mL 三角瓶中，按照1.4.4 實驗設計加入相應量的添加物，以WTS 與水1∶3 的比例加入自來水后混勻室溫浸泡10 h，121 ℃滅菌20 min。冷卻后無菌操作將種子液以不同的接種量接種到上述三角瓶中，混合均勻，恒溫30 ℃靜置培養，每24 h 輕搖1 次。

1.4.4 PB 設計實驗方案

PB 設計可利用最少的實驗次數，從考查的眾多因素中快速篩選出主要影響效應［3］。根據單因子實驗結果，PB 設計(N=12)對影響WTS 發酵生產類胡蘿卜素的10 種因素進行了評估，10 種因素的編碼、單位及水平見表1。

表1 PB 設計試驗所選因子、水平及編碼Table 1 The two levels of variables and codes used in the Plackett-Burman design

注:①指250 mL 三角瓶中裝載WTS 的質量;②指種子液與固態發酵基質比例(v/w)。Note:①The quantity of WTS in a 250 mL Erlenmeyer flask;②The ratio of the seed broth to fermentation substrates(v/w).

1.5 分析方法

1.5.1 酵母生物量分離及測定

固態發酵培養一定時間后，向含發酵物的三角瓶中加入適量生理鹽水，雙層紗布過濾獲得菌體濾液后定容。20 mL 菌體濾液8 000 rpm 離心10 min，棄除上清，收集菌體，無菌水洗滌2 次，105 ℃烘至恒重，稱重并計算生物量［14］。

1.5.2 菌體類胡蘿卜素的提取及含量測定

一定量的濕菌體經鹽酸-熱處理破壁后，用丙酮抽提類胡蘿卜素。類胡蘿卜素的提取參照文獻［15］進行。用紫外可見分光光度計測定色素提取液485 nm 處吸光度，按下式計算類胡蘿卜素含量:

式中，Aλmax為色素最大吸收波長處的吸光度;D為測定試樣的稀釋倍數;V 為提取色素所用溶劑量(mL);W 為菌體重量(g);0.16 為類胡蘿卜素的消光系數。根據菌體細胞類胡蘿卜素含量計算固態發酵物中類胡蘿卜素的產量。

1.5.3 數據分析

實驗數據采用Design-Expert 8.0.6 統計分析軟件進行處理。

2 結果與討論

2.1 WTS 成分分析

WTS 中含有大量可溶性糖、煙堿等水溶性物質，其主要成分如表2。因此，經水浸泡后WTS 可作為一種廉價的固態發酵基質。發酵基質顆粒大小在固態發酵過程中起重要的作用，小顆粒基質能夠提供更大的微生物作用表面，因此固態發酵中多采用小顆粒基質［16］。采用小顆粒基質，發酵后酵母細胞很難與基質顆粒分離。本實驗中采用大顆粒的WTS 進行發酵，發酵后通過簡單的過濾即可獲得高純度的酵母細胞，因此有利于規模化生產過程中類胡蘿卜素及其它高附加值產物的分離和提取。

表2 預處理煙梗的成分分析(g/L)Table 2 The main compositions of WTS used in this study(g/L)

2.2 PB 設計試驗方案及其結果

PB 設計實驗中，生物量、色素含量及色素產量的響應值見表3。從表3 可看出:對生物量而言，最小的響應值為51.30 mg/g，最大響應值為89.45 mg/g;類胡蘿卜素的最小和最大響應值分別為8.91 μg/g 和21.54 μg/g。色素含量在試驗過程中變化也較大，第6 次試驗中，以煙梗為唯一基質，色素含量為173.68 μg/g，其它11 次試驗中色素含量均不同程度升高，表明添加因子對JLC 色素的累積有正效應。總的來說，在12 次試驗中生物量、色素含量和色素產量變化均較大，表明在PB 設計中所選因子對響應值影響較大。

表3 PB 設計試驗方案及結果Table 3 Plackett-Burman design matrix with biomass and carotenoid production

2.3 PB 設計試驗的方差分析

Prob＞F 值的大小能夠表示模型及各個因子的顯著性情況，當Prob＞F 值小于0.05，表明有顯著影響，當Prob＞F 值小于0.01，表明有極顯著影響［19］。對PB 設計試驗結果進行方差分析見表4，結果表明，實驗模型達到顯著水平。在實驗選擇的10 個因素中，蛋白胨、葡萄糖和NaNO3對實驗模型影響不顯著，而蔗糖、酵母粉、(NH4)2SO4、裝載量和培養時間對實驗模型影響顯著。

表4 PB 設計試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman design experimental results

注:①Prob＞F 小于0.05，表明模型或參數有顯著影響;Prob＞F 小于0.01，表明模型或參數有極顯著影響。Note:①Prob＞F less than 0.05，indicates that the model or parameters have a significant effect;②Prob＞F less than 0.01，indicates that the model or parameter has an extremely significant effect.

2.4 供試因子對PB 設計試驗模型的貢獻度

貢獻度(% contribution)指模型中的某因子的平方和占模型中各因子平方和總和的百分數，其值越大表明該因子對實驗結果的影響越大［17］。供試因子對類胡蘿卜素產量的貢獻度見表5，結果表明，裝載量、培養時間和酵母粉對模型貢獻度相對較大，而蛋白胨、(NH4)2SO4、蔗糖等因素對模型貢獻度相對較小。

根據因子的貢獻度和Prob＞F 值綜合考慮，培養時間、裝載量和酵母粉是影響JLC 固態發酵產類胡蘿卜的重要因子，因此在下一步的放大發酵研究中對這3 個因素進行優化，有望進一步提高類胡蘿卜產量。

表5 PB 設計試驗中供試因子對類胡蘿卜素產量的貢獻度(%)Table 5 The contribution of the tested variables to carotenoids production in Plackett-Burman design(%)

3 結論

深紅酵母JLC 固態發酵WTS，發酵后簡單過濾即可獲得高純度酵母細胞，有利于類胡蘿卜素的提取，同時也有利于其它高附加值酵母成分的提取。裝載量、培養時間和酵母粉是影響類胡蘿卜素產量的關鍵因素。因此，以WTS 為主要基質，添加適量酵母粉，通過優化裝載量和培養時間固態發酵生產類胡蘿卜素，既可資源化利用WTS，又可獲得天然類胡蘿卜素。通過PB 實驗，菌株JLC 類胡蘿卜素的最大產量為21.54 μg/g，進一步優化有望提高類胡蘿卜素產量。

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