UPLC-MS 法測定羊耳菊中6 種成分的含量

侯靖宇，陸 苑，3，潘 潔，蘭燕宇，李 春，3，陳思穎，3，王永林，3*

1 貴陽醫學院 貴州省藥物制劑重點實驗室;2 貴陽醫學院 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心;3 貴陽醫學院藥學院，貴陽 550004

羊耳菊又名白牛膽、山白芷，為菊科旋覆花屬植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的新鮮或干燥全草，以根或全草入藥，具有疏風散熱、解毒消腫之功效，收載于《中華本草·苗藥卷》、2003 版《貴州省中藥、民族藥質量標準》［1，2］，為貴州苗族常用藥材，民間常用于治療感冒發熱、咽喉腫痛、風濕疼痛、癰瘡疔毒等［3］。近年來對羊耳菊的化學成分研究報道較多，其主要成分有酚類、倍半萜類、有機酸類、黃酮類和揮發油類等［4］，但目前關于羊耳菊的質量研究卻較少?！顿F州省中藥、民族藥質量標準》中尚未收載羊耳菊的含量測定項目，經文獻查閱，也僅有羊耳菊單一成分及總黃酮測定［5，6］，不能全面反映其內在質量。本課題組前期研究及相關文獻報道表明［4］，羊耳菊中東莨菪苷、1，3-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草苷、3，4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷?，5-O-二咖啡?；鼘幩岬龋哂锌寡?、抗菌、抗氧化及抗病毒等藥理作用［7-13］。UPLC-MS/MS 專屬性強，靈敏度高，快速準確，越來越多地應用于中藥材質量控制等各方面的研究中［14，15］，因此研究者應用UPLCMS/MS，以葛根素為內標，建立羊耳菊中6 個成分的含量測定方法，為有效控制羊耳菊的內在質量提供了科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY 系統超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀，包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、三重四級桿質量分析器和Masslynx4.1 質譜工作站(美國Waters 公司)。

1.2 材料

東莨菪苷對照品(批號13061442，純度≥98%)由上海同田生物技術有限公司提供;1，3-O-二咖啡?；鼘幩?、3，4-O-二咖啡?；鼘幩?、3，5-O-二咖啡?；鼘幩帷?，5-二-O-咖啡?；鼘幩釋φ掌?均由中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心提供，批號分別為1384-101215、1384-101215、S34-110121、1384-101215，純度≥98%);葛根素和木犀草苷對照品(均由中國食品藥品檢定研究院提供，批號分別為111-090623、111720-200602，純度≥98%);甲醇(天津科密歐化學試劑有限公司)、乙腈(德國Merck 公司)、甲酸(美國TEDIA 有限公司)為色譜純;其他試劑均為分析純，水為超純水。羊耳菊藥材:共6 批樣品，來源于貴州高坡、龍里及羅甸等地，由貴陽醫學院龍慶德副教授鑒定為菊科植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的干燥全草。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液

分別精密稱取東莨菪苷等6 種對照品，各置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度處，搖勻。得東莨菪苷(0.504 mg/mL)、1，3-O-二咖啡酰基奎寧酸(1.037 mg/mL)、木犀草苷(0.856 mg/mL)、3，4-O-二咖啡酰基奎寧酸(1.007 mg/mL)、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸(0.502 mg/mL)、4，5-O-二咖啡?；鼘幩?1.073 mg/mL)的儲備液。

2.1.2 內標溶液

精密稱取葛根素(1.148 mg)，用甲醇定容至10 mL。獲得葛根素(0.1148 mg/mL)的儲備液。取內標儲備液適量至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 μg/mL 的內標溶液，置冰箱(-20 ℃)保存，備用。

2.1.3 供試品溶液

取羊耳菊細粉約1.0000 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入25%乙醇25 mL，稱定重量(精確至0.01 g)，加熱回流提取2 h，放冷，再稱定重量，用提取液補足減失的重量，搖勻，過濾，精密吸取續濾液5 mL于蒸發皿，揮干溶劑;殘余物轉移至25 mL 容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱，保護柱:Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm);柱溫:45 ℃;流速:0.35 mL/min;進樣體積為1 μL;流動相:0.1% 甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫，洗脫程序如下:0～1.0 min，5%～15%(A);1.0～3.8 min，15%～18%(A);3.8～4.0 min，18%～90%(A);4.0～5.0 min，90%～5%(A)。

2.3 質譜條件

采用電噴霧電離源(ESI)，毛細管電離電壓3 kV，離子源溫度120 ℃;去溶劑氣N2，流速650 L/h，去溶劑氣溫度350 ℃，離子源溫度120 ℃;碰撞氣Ar，流速0.16 mL/min。掃描方式為多反應離子監測(MRM)，監測離子見表1。

表1 質譜條件Table 1 MRM conditions for the 6 compounds

2.4 專屬性試驗

精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液適量并加入內標(葛根素)溶液，15000 rpm，離心5 min 取上清液1 μL 進樣，結果見圖1。由圖可見，被測定成分間分離良好，未有雜質干擾，比較供試品溶液和對照品的母離子、子離子質譜圖，兩者一致，表明本法專屬性良好。

圖1 混合對照品溶液(A)和供試品溶液(B)的UPLC-MRM-MS 圖譜Fig.1 MRM total ion chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.5 線性試驗

精密吸取“2.4”項下制備的混合對照品溶液適量，依次稀釋，制得6 個濃度的系列濃度線性工作液，分別進樣測定。以對照品濃度(c)為橫坐標X，色譜峰面積與內標峰面積比值(A/Ai)為縱坐標Y，進行線性回歸，得回歸方程見表3。

表2 6 種成分的線性關系Table 2 Linear relationships of 6 investigated compounds

2.6 重復性試驗

取同批次羊耳菊藥材，按“2.1”項下方法平行制備6 份供試品溶液，處理后分別進樣測定，根據內標法計算得1～6 平均含量分別為0.211、2.083、0.036、2.573、0.087 和0.233 mg/g，RSD 分別為5.27%、4.24%、3.16%、1.51%、1.53%和2.96%，表明本方法重復性良好。

2.7 精密度試驗

取與重復性一致的同一批號的供試品溶液，連續測定3 d，每天進樣6 次，依據內標法計算含量，結果1～6 的日內及日間精密度(n=6)RSD 分別為1.02%～3.31%和1.35%～3.11%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別處理后于0、2、4、8、12 h 進樣分析，1～6 含量的RSD 分別為1.94%、1.54%、3.49%、1.87%、2.83%，5.79%，表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取6 份已知含量的羊耳菊樣品適量，平均分為3 組，分別精密加入0.5、1.0、2.0 mL 混合對照品溶液(1～6 濃度分別為0.042、0.130、0.063、0.210、0.126、0.134 mg/mL)，制成低、中、高濃度的質控樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按上述條件進樣測定，計算加樣回收率，結果表3。

表3 回收率實驗結果(%，n=3)Table 3 Results of recovery(%，n=3)

2.10 樣品測定

按“2.1.3”項下方法制備6 批樣品的供試品溶液，處理后分別進樣測定，根據內標法計算樣品中各成分的含量，結果見表4。

表4 6 批樣品中6 個成分的含量(mg/g，n=3)Table 4 Content determination results of 6 compounds from six batches of I.cappa sample(mg/g，n=3)

3 討論與結論

UPLC 使用1.7 μm 顆粒度的色譜柱填料，能顯著提高分離的效率，UPLC-MS/MS 法在不影響分離效果的情況下大大提高了樣品中各成分的分析速度。本研究首次建立了羊耳菊藥材的多指標成分含量測定方法，且采用UPLC-MS/MS 法，在6 min 內即可同時準確測定羊耳菊中6 個成分的含量，為羊耳菊的質量控制提供了一種快速靈敏、穩定可靠的新方法。

實驗中考察了以甲醇、無水乙醇、25% 乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水為提取溶劑，分別用索氏提取、回流提取和超聲處理，以及不同時間對羊耳菊進行提取，對測定結果綜合分析后，最后采用25%乙醇加熱回流提取2 h，6 種成分的提取效率較好。

通過貴州不同產地的6 批羊耳菊藥材含量測定結果可以看出，羊耳菊中6 種成分的含量存在明顯差異，其中貴州龍里產的藥材含量較高，說明生態環境、采收時間和儲存條件等可能對含量產生影響。上述結果提示，為保證羊耳菊相關制劑批次間質量的一致性，應加強羊耳菊的質量控制，必要時固定藥材的來源。

1 Chinese Herbalism Editorial Board，State Administration of Traditional Chinese Medicine of the People＇s Republic of China(國家中醫藥管理局中華本草編委會).Traditional Chinese Medicine(中華本草).Guiyang:The Guizhou Science Press，2005.273-274.

2 Food and Drug Administration of Guizhou(貴州省藥品監督管理局).Quality Standard of Traditional Chinese Medicine and National Raw Material for Medicine Guizhou Province(貴州省中藥材、民族藥材質量標準).Guiyang:The Guizhou Science Press，2003.176.

3 Editorial Committee of the Administration Bureau of Chinese Plant Medicine(中國科學院中國植物志編輯委員).Chinese Flora(中國植物志).Beijing:Science Press，1985.Vol.75，271-272.

4 Guan HY(關煥玉)，Lan YY(蘭燕宇)，Liao SG(廖尚高)，et al.Caffeoylquinic acid derivatives from Inula cappa.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)2014，26:1948-1952.

5 He X(何迅)，Wang AM(王愛民)，Li YJ(李勇軍)，et al.Determination of 4，5-O-dicaffeoy-lquinic acid content in Herba inulae cappae by HPLC.Chin J New Drugs(中國新藥雜志)，2010，19:1084-1086.

6 Huang Y(黃勇)，Zheng L(鄭林)，Li YJ(李勇軍)，et al.Study on the method for determination of total flavonoids in Herba inulae cappa.Shaanxi J Tradit Chin Med(陜西中醫)，2008，29:1391-1392.

7 Hu L(胡琳)，He ZS(賀正山).Progress of constituents and pharmacological activities of Inula cappa.Chin J Mod Appl Pharm(中國現代應用藥學)，2012，29:889-894.

8 Liu WJ(劉衛今)，Ge T(葛婷)，Liu SG(劉勝貴)，et al.Extraction of flavonoids from Inula cappa and its antibacterial activity.Hubei Agric Sci(湖北農業科學)，2010，49:426-429.

9 Liu SG(劉勝貴)，Li J(李軍)，Chen FC(陳富成)，et al.Studies on the antimicrobial activities of aqueous from Inula cappa DC.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫國藥)，2009，20:3072-3074.

10 Liu SG(劉勝貴)，Chen FC(陳富成)，Li J(李軍).Antimicrobial dynamics of Inula cappa extracts.J Anhui Agric Sci(安徽農業科學)，2010，38:14322-14324.

11 Xie HT(謝慧婷)，Wang J(王靜)，Chen ZD(陳振東)，et al.Antimicrobial compound isolated from Inula cappa and its inhibitory characteristics.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2012，24:1534-1537.

12 Mo JJ(莫佳佳)，Xu MD(徐慕蝶)，Yang DD(楊丹丹)，et al.Experimental study on anti-inflammatory and analgesic effects of ethanol extracts of Dong-medicine Inula cappa.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學)，2012，18:258-260.

13 Liu SG(劉勝貴)，Chen JJ(陳鳩鳩)，Li J(李軍)，et al.Antimicrobial effects of Inula cappa organic solvent extracts.Liaoning J Tradit Chin Med(遼寧中醫雜志)，2010，37:398-400.

14 Liu Y(劉躍)，Hu J(胡杰)，Xie YM(謝玉敏)，et al.Determination of seven components in Polygonum capitatum by UPLC-MRM-MS.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2015，27:73-76.

15 Guo YW(郭躍偉).Application of liquid chromatography/spectroscopy(UV，MASS and NMR)hephenated technology in the study of bioactive substances from Chinese traditional herbs.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2003，15:456-461.