莪術(shù)油中吉馬酮的分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定

吳 杰，古金華，馮 鈺，陳偉強(qiáng)，葉連寶

廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣州 510006

莪術(shù)(Curcuma zedoaria)是姜科植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)和溫郁金的干燥根莖，主要產(chǎn)于廣西、云南、貴州和浙江等多個(gè)省區(qū)，具有行氣破血、消積止痛之功效。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)油還具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用［1，2］。莪術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分復(fù)雜，多為倍半萜類化合物，目前已經(jīng)確定的結(jié)構(gòu)有20 多種［3，4］，吉馬酮(圖1)是莪術(shù)油中的主要成分之一［5］，其有較強(qiáng)抗腫瘤、抗菌、抗病毒等活性［6-10］。由于吉馬酮熔點(diǎn)低、分離純化不方便，目前國內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道其分離純化方法，本實(shí)驗(yàn)以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑，采用硅膠色譜柱進(jìn)行粗分，然后以甲醇-水為流動(dòng)相，半制備液相制備，較方便的得到高純度的吉馬酮，為吉馬酮的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與儀器

圖1 吉馬酮化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of germacrone

RV8V-C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA 公司)、電熱真空干燥箱(天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、XR6A顯微熔點(diǎn)儀(上海精密儀器廠)、Bruker Plus 400 核磁共振波譜儀(瑞士Bruker 公司)、日立高效液相色譜儀(日本日立公司)、島津LC-8A 半制備液相色譜儀(日本島津公司)。莪術(shù)油、吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):PS14022101)(成都普斯生物有限公司)，硅膠(200～300 目)(青島化工)、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、無水硫酸鈉(均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 吉馬酮的分離

取莪術(shù)油約100 g，加少量石油醚混勻，取層析柱(內(nèi)徑15 cm，長180 cm)，加入層析用硅膠(200～300 目，已干燥6 h)4000 g，石油醚(60～90 ℃)裝柱，將備用莪術(shù)油樣品濕法裝柱。先用石油醚(60～90 ℃)洗脫，再以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(100∶1)洗脫，吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行薄層對(duì)照，合并洗脫液，濃縮，冷藏保存。

2.2 吉馬酮的純化

通過半制備液相［色譜條件:Kromasil C18色譜柱(250×30 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(90∶10);檢測(cè)波長為220 nm，柱溫30 ℃，流速為9.0 mL/min，進(jìn)樣量0.4 mL］的制備，得到純化后的目標(biāo)產(chǎn)物。減壓濃縮后得到乳白色甲醇水溶液，石油醚(30～60 ℃)萃取，分離石油醚層，無水硫酸鈉干燥，濃縮得吉馬酮。

2.3 結(jié)構(gòu)確認(rèn)

2.3.1 熔點(diǎn)檢查

照熔點(diǎn)測(cè)定法(2010 年版中國藥典一部附錄VllC)第一法［11］測(cè)定產(chǎn)物的熔點(diǎn)，測(cè)得熔點(diǎn)為53～55 ℃。與吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品(53～55 ℃)一致。

2.3.2 薄層檢查

取產(chǎn)物樣品以石油醚溶解，得樣品溶液;另取標(biāo)準(zhǔn)品以石油醚溶解，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液，吸取相同體積的溶液點(diǎn)于同一薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(80∶1)為展開劑展開，取出，晾干，在紫外燈(254 nm)下觀察所得薄層色譜圖Rf值為0.4，且均只有一點(diǎn)顯色。

2.3.3 高效液相檢查

2.3.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

Kromasil C18柱(250×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水(80∶20)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長為220 nm;柱溫30℃;流速為1.0 mL/min。

2.3.3.2 供試品溶液的制備

精密稱取樣品1.253 mg 置10mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻，備用。

2.3.3.4 測(cè)定法

精密吸取供試品和標(biāo)準(zhǔn)品各20 μL 注入液相色譜儀中，測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算，樣品純度為99.0%(圖譜如圖2)。

圖2 純化前樣品(A)、吉馬酮半制備樣品(B)、純化后吉馬酮樣品(C)、吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品(D)高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of unpurified sample(A)，semi-purified germacrone(B)，purified germacrone(C)and germacrone standard(D)

2.3.4 核磁共振波譜檢查

純化的吉馬酮核磁數(shù)據(jù)如下:1H NMR(CDCl3):δ 4.96(1H，br，d，J=11.7 Hz，H-1)，4.69(1H，br，d，J=8.6 Hz，H-5)，3.38(1H，br，d，J=10.2 Hz，H-9)，2.90(1H，br，d，H-9)，2.93(1H，br，d，H-6)，2.83(1H，br，d，J=11.4 Hz，H-6)，2.36～2.09(m，2H，CH2)，2.13～2.04(m，2H，CH2)，1.74(3H，s，CH3)，1.72(3H，s，CH3)，1.63(3H，br，s，CH3)，1.43(3H，br，s，CH3);13C NMR(CDCl3):δ 207.9(C-8)，137.2(C-4)，132.7(C-1)，132.7(C-11)，129.5(C-7)，126.7(C-10)，125.4(C-5)，55.9(C-9)，38.1(C-3)，29.2(C-6)，24.1(C-2)，22.3(C-12)，19.9(C-13)，16.7(C-15)，15.6(C-14)。

3 討論

隨著近年來癌癥發(fā)病率和死亡率的提高，有關(guān)中藥莪術(shù)抗腫瘤的藥學(xué)研究備受矚目。莪術(shù)油是目前已經(jīng)上市的一種很好的抗腫瘤藥物，而莪術(shù)油中的有效成分就成為了目前研究的熱門，莪術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分復(fù)雜，多為倍半萜類化合物，具有沸點(diǎn)高、高溫下易氧化等特點(diǎn)，加熱時(shí)間過長可能引起分解與轉(zhuǎn)化，影響其抗癌功效，并且同分異構(gòu)體多，理化性質(zhì)極為相近，因此，尋找一種高效簡便的分離純化方法成為了莪術(shù)油有效成分研究的關(guān)鍵。而吉馬酮作為其中得一種重要成分，具有很強(qiáng)的研究價(jià)值。

由于揮發(fā)油本身易揮發(fā)性，在分離純化的過程中存在不易得到樣品的問題，在將制備液相純化后的溶液進(jìn)行減壓蒸餾的過程中，55 ℃減壓蒸餾可將大部分甲醇除去，得到不溶于水的產(chǎn)物溶液，呈現(xiàn)乳白色，繼續(xù)升溫75 ℃，減壓蒸餾除去水的過程中，當(dāng)溶液基本除盡后，產(chǎn)物樣品也基本全部損失。本實(shí)驗(yàn)通過萃取的方法利用低沸點(diǎn)石油醚對(duì)其進(jìn)行純化，避免了高溫旋蒸對(duì)吉馬酮的破壞;也最大程度上保證了產(chǎn)物的收率，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;同時(shí)在分離的過程中通過多次實(shí)驗(yàn)，考察得到較為精細(xì)的流動(dòng)相系統(tǒng)，避免了多次分離對(duì)產(chǎn)物含量的損失，提高了分離純化的效率，為吉馬酮的后續(xù)研究提供參考。

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