淫羊藿素促進BMSCs 成軟骨分化的研究

汪建樣，殷嫦嫦，王子瑤，耿書國，胡文龍，殷 明

1 南昌大學第二附屬醫院;2 南昌大學研究生院醫學部，南昌 330006;3 九江學院，九江 332000

關節軟骨屬于透明軟骨，營養供應和代謝產物的排泄需要通過關節液，一旦發生損傷難以自我修復和再生［1］。軟骨損傷很容易引起關節結構和功能的破壞，導致劇烈的疼痛和功能障礙，甚至致殘［2］。傳統的治療方案只能緩解疼痛、維持關節的功能，但不能恢復軟骨的結構和生物力學特性。目前，軟骨組織工程技術被認為是治療軟骨損傷的最有前景的方法之一，可能能夠在更大程度上改善患者生活質量、延緩關節退變及人工關節置換［3］。生長分化因子(GDF)5 是骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)超家族成員之一，能夠誘導BMSCs 成軟骨分化［4］。淫羊藿素(Icaritin，ICT)是淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷的的衍生物。大量研究表明，ICT 具有類雌激素作用、抗氧化、防治骨質疏松、促進成骨分化、防治前列腺癌、肝癌、腎癌、乳腺癌等作用［5］。但淫羊藿素體外對于BMSCs 向軟骨細胞分化作用的研究尚少。本次實驗我們利用GDF-5 聯合ICT 體外誘導大鼠BMSCs 向軟骨細胞分化，探討淫羊藿素體外是否能夠促進BMSCs 向軟骨細胞分化，為軟骨損傷治療提供實驗參考。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

3 周齡SPF 級SD 大鼠(雌雄不限)，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格號:43004700014337。試驗單位使用許可證編號:SYXK(贛)2012-0002。

1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養基(Hyclone 公司)，胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(GIBCO 公司)，Recombinant murine GDF-5(PEPROTECH 公司)，淫羊藿素(上海原葉，HPLC≥98%)，Alcian Blue 8GX(Solarbio 公司)，GREENspin 細胞RNA 快速提取試劑盒(北京莊盟)，HiFiScript 快速去基因組cDNA 第一鏈合成試劑盒，2×Taq Master Mix、DNA Ladder 2000(SinoBio)，引物合成(上海生工生物)，總蛋白提取試劑盒(普利萊基因技術有限公司)，Prestained Protein Ladder(Thermo Scientific 公司)，GAPDH 多克隆抗體、COL1A2 多克隆抗體(Proteintech 公司)，Anti-Collagen II antibody(abcam 公司)，Goat Anti-Rabbit IgG，HRP(康為世紀)，高靈敏度化學發光檢測試劑盒(康為世紀)。

2 實驗方法

2.1 BMSCs 分離、培養

本研究團隊已建立了rBMSCs 的分離、培養及純度鑒定的研究實驗條件［6］。取3 周齡SPF 級SD大鼠，頸椎脫臼法處死，75%酒精浸泡30 min，消毒后無菌分離出股骨和脛骨，采用全骨髓貼壁法分離rBMSCs。用含10% FBS 的DMEM/F12 培養基重懸細胞接種于塑料中，72 h 后換液，以后每2 d 換液一次，待細胞生長至90%時按1∶2 傳代。反復貼壁純化，取P3 代細胞進行實驗，并用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。

2.2 BMSCs 向軟骨細胞分化

取P3 代細胞，常規消化后，調整細胞密度為1×105/mL，接種于24 孔板中，同時將細胞密度調整為1×106/mL 接種于6 孔板中，并按以下分組進行誘導:(1)對照組;(2)Icaritin 組;(3)GDF-5 組;(4)Icaritin+GDF-5 聯合組。上述各組細胞均采用10%FBS+DMEM/F12 培養基培養，其中Icaritin 的終濃度為5 μmol/L，GDF-5 的終濃度為100 ng/mL，每2 d 換液一次，誘導培養14 d，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。

2.3 蛋白聚糖的Alcian Blue 染色

取誘導培養14 d 后的24 孔板進行Alcian Blue染色，PBS 漂洗3 次×5min，4% 多聚甲醛固定30 min，PBS 漂洗1 次，0.1 mol/L 鹽酸溶液漂洗5min使pH 降至1.0，1% Alcian Blue 染色過夜，最后用0.1 mol/L 鹽酸溶液洗脫非特異性染色。倒置相差顯微鏡下觀察染色情況。

2.4 RT-PCR 檢測成軟骨分化相關基因表達

取誘導培養14 d 后的6 孔板，按GREENspin 細胞RNA 快速提取試劑盒說明提取細胞總RNA。按HiFiScript 快速去基因組cDNA 第一鏈合成試劑盒說明將RNA 逆轉錄成cDNA，按2×Taq Master Mix說明進行擴增。PCR 擴增反應體系:cDNA 1 μL、上游和下游引物各1 μL、2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總反應體系25 μL。擴增后產物用1%瓊脂糖凝膠電泳25 min 左右。SIM 凝膠成像系統拍照并分析條帶灰度值。內參為GAPDH，目的基因為:Aggrecan、Col2a1、Col1a1、Sox9，引物序列和產物大小見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 Sequences of primers

2.5 Western Blot 檢測軟骨標記蛋白表達

取誘導培養14 d 后的6 孔板，按總蛋白提取試劑盒說明提取細胞蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度。加入4×蛋白質上樣緩沖液95 ℃水浴5 min 變性。每組蛋白上樣量為30 μg，在SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠中電泳;然后用濕轉法將凝膠中的蛋白轉至PVDF 膜上;將PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉的TBST 中室溫封閉2 h;分別加入 GAPDH(1∶3000)、Col2(1∶5000)、Col1(1∶8000)一抗工作液室溫孵育2 h，1×TBST 漂洗3 次，每次5 min;用含標記辣根過氧化物酶的二抗(1∶6000)室溫孵育2 h;漂洗后于暗室用ECL 試劑盒進行曝光、顯影、定影。晾干后，以GAPDH 為內參，用ImageJ 進行灰度分析。

2.6 統計學分析

采用SPSS 19.0 統計軟件進行試驗數據分析，數據均以±s 的形式表示。計數資料兩樣本間率的比較采用χ2檢驗，檢驗水平α=0.05，組間比較采用單因素方差分析。

3 實驗結果

3.1 rBMSCs 的形態學觀察

大鼠骨髓間充質干細胞原代培養接種于培養瓶中，第3 d 部分細胞貼壁生長，呈長梭形、多角形(圖1A)，第10 d 細胞呈集落生長，漩渦狀，近似魚群樣分布但有少量雜細胞，約90%融合(圖1B)。傳至P3 代，細胞形態基本均一，長梭形或扁平狀，呈典型密集旋渦狀、魚群樣排列貼壁生長(圖1C)。

圖1 BMSCs 原代培養3d(A)、BMSCs 原代培養10d(B)及BMSCs 第三代培養3d(C)的細胞形態學觀察(×100)Fig.1 Cellular morphology observation of primary BMSCs cultured for 3 days(A)，primary BMSCs cultured for 10 days and BMSCs at passage 3 cultured for 3 days(C)(×100)

3.2 rBMSCs 成軟骨分化的形態改變及蛋白聚糖的Alcian Blue 染色結果

圖2 對照組(A)、淫羊藿素(B)、GDF-5 組(C)及Icaritin+GDF-5 聯合組(D)連續誘導14 d 后細胞形態變化及分泌蛋白多糖量的變化(×100)Fig.2 The morphological changes and content of cells secretory proteoglycan changes in control group(A)，Icaritin group(B)，GDF-5 group(C)and Icaritin+GDF-5 group(D)induced for 14 days(×100)

各組細胞隨著誘導時間的延長密度逐漸增加，淫羊藿素(Icaritin)組、GDF-5 組、Icaritin+GDF-5 聯合組細胞形態都由長梭形逐漸向短梭形、三角形、類圓形轉變，細胞體積逐漸縮小，胞漿豐富。且Icaritin+GDF-5 聯合組(圖2D)最為明顯，GDF-5 組(圖2C)和淫羊藿素組(圖2B)次之，而對照組(圖2A)變化最小。連續誘導14 d 后，對照組(圖2A)并沒有明顯的蛋白聚糖染色，淫羊藿素組(圖2B)、GDF-5 組(圖2C)、Icaritin+GDF-5 聯合組(圖2D)Alcian Blue 染色后顏色由淺到深。說明誘導后四組細胞分泌蛋白聚糖的量逐漸增加。

3.3 RT-PCR 結果

RT-PCR 檢測結果分析表明，與對照組相比，Icaritin 組、GDF-5 組及Icaritin+GDF-5 聯合組軟骨標記基因Aggrecan、Col2、Sox9 表達量均明顯增加(P＜0.05)，相反成骨分化相關基因Col1a1 表達量明顯減少(P＜0.05)，但是Icaritin 組Col1a1 表達量增加(P＜0.05)。與GDF-5 組比較，Icaritin+GDF-5聯合組Aggrecan、Col2、Sox9 基因表達量也增加(P＜0.05)，相應的Col1a1 表達量下降(P＜0.05)(圖3)。

圖3 BMSCs 誘導14 d 后成軟骨分化相關基因的表達水平Fig.3 Gene relative expression level detected at day 14 after induction

圖4 BMSCs 誘導14 天后相關蛋白的表達水平Fig.4 Protein relative expression of COL2 and COL1 after 14 days of induction

3.4 Western Blot 檢測結果

Western Blot 檢測結果灰度分析表明，相比于BMSCs 組，各誘導組Ⅱ型膠原蛋白表達量均明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05);相對于BMSCs+GDF-5 組，BMSCs+GDF-5+ICT 組Ⅱ型膠原蛋白表達量增加(P＜0.05)。與BMSCs 組相比，BMSCs+ICT 組I 型膠原蛋白相對表達量增加(P＜0.05)，而BMSCs+GDF-5 組及BMSCs+GDF-5+ICT 組表達減少(P＜0.05);與BMSCs+GDF-5 組相比BMSCs+GDF-5+ICT 組I 型膠原蛋白表達減少(P＜0.05)(圖4)。

4 討論與結論

BMSCs 是一種多能干細胞，擁有強大的自我更新和良好的分化潛能，在一定的條件下，其可以向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等分化［7］。由于它具有來源廣、易得到、易于培養擴增、低免疫原性、能與軟骨下骨很好的融合［8］等優點，被廣泛用于軟骨組織工程。GDF-5 也被稱為軟骨衍生形態發生蛋白-1(CDMP-1)，在胚胎發育階段能夠促進肢體發育，參與肌腱、韌帶、神經、皮膚、骨及軟骨損傷修復［9］。在肢體發育的早期，GDF-5 表達于軟骨基原的間充質干細胞凝集區;隨后它的表達僅局限于關節形成的中心區域，是滑膜關節的正常形態和發育所必須的［10］。此外，GDF-5 還表達于成年人關節軟骨組織中，參與軟骨表型和功能的維持［11］。有研究表明:GDF-5 能夠誘導干細胞成軟骨分化，增加其蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達［4］。

淫羊藿是一味傳統的中草藥，根據中國藥典記錄，我國人民采用該藥來壯骨強腎有幾千年的歷史，利用現代的藥物分析手段研究該藥的成分發現:其主要的藥物成分為黃酮類化合物，統稱為淫羊藿總黃酮，進一步的研究證明:淫羊藿總黃酮中主要的活性單體為淫羊藿苷，淫羊藿苷屬于具有戊二烯結構的黃酮苷［12］。Zhang L 等［13］研究發現淫羊藿苷能夠促進軟骨細胞細胞外基質的合成和基因的表達，有利于軟骨細胞表型的維持。淫羊藿素(Icaritin，ICT)作為淫羊藿苷的衍生物，是其體內代謝后的主要活性產物，與其前體物質淫羊藿苷具有極其相似的分子結構，具有抗氧化、防治骨質疏松、促進成骨細胞生長和增殖、治療心血管疾病、保護神經變性損傷、防治乳腺癌等作用［14］。有研究表明:低濃度(4、8 μmol/L)的淫羊藿素能夠促進大鼠軟骨細胞增殖抑制其凋亡［15］，而高濃度則沒有這個作用。本實驗前期選用1、5、10、20 μmol/L 的ICT 分別聯合100 ng/mL 的GDF-5 誘導rBMSCs 分化，Alcian Blue 染色結果提示5 μmol/L 效果最好。因此，本實驗采用5 μmol/L 的淫羊藿素聯合100ng/mL 的GDF-5 誘導rBMSCs 成軟骨分化，實驗結果表明5 μmol/L 淫羊藿素的淫羊藿素具有促進GDF-5 誘導的細胞合成和分泌蛋白多糖，促進Aggrecan、Col2、Sox9 mRNA表達，促進Ⅱ型膠原蛋白表達抑制Ⅰ型膠原蛋白表達。其中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白是透明軟骨細胞分泌的特異性的軟骨細胞外基質的主要成分，Sox9是一種高遷移率族蛋白(HMG-box)轉錄因子，是間質祖細胞成軟骨分化早期階段的標志［16］。成軟骨分化標記基因Aggrecan、Col2、Sox9 mRNA 及Ⅱ型膠原蛋白表達量明顯增加提示GDF-5 聯合ICT 能夠誘導BMSCs 向軟骨軟骨細胞分化。與單獨GDF-5組相比，添加ICT 組上述基因和蛋白表達水平明顯增加(差異有統計學意義)，說明淫羊藿素體外能夠促進rBMSCs 成軟骨分化。此外，淫羊藿素能夠導入聚乙烯-磷酸三鈣(PLGA-TCP)形成新的多孔復合支架，它能持續釋放ICT，并且有很好的生物相容性［17］，有利于ICT 用于軟骨損傷的治療的應用。

綜上所述，GDF-5 聯合淫羊藿素能夠誘導rBMSCs 成軟骨分化，其中5 μmol/L 淫羊藿素能夠促進GDF-5 誘導的細胞成軟骨分化，為應用ICT 治療軟骨損傷提供實驗基礎。

1 Counsel PD，Bates D，Boyd R，et al.Cell therapy in joint disorders.Sports Health:A Multidisciplinary Approach，2015，7:27-37.

2 Chu CR，Millis MB，Olson SA.Osteoarthritis:From palliation to prevention.J Bone Joint Surgery，2014，9:130.

3 Mardones R，Jofré CM，Minguell JJ.Cell therapy and tissue engineering approaches for cartilage repair and/or regeneration.Int J Stem Cells，2015，8:48-53.

4 Feng G，Wan Y，Balian G，et al.Adenovirus-mediated expression of growth and differentiation factor-5 promotes chondrogenesis of adipose stem cells.Growth Factors，2008，26:132-142.

5 Zhang SQ.Ultra-high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the quantification of icaritin in mouse bone.J Chromatogr B，2015，978:24-28.

6 He DW(何丁文)，Yin CC(殷嫦嫦)，Gu YR(顧玉榮)，et al.Differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into neural-like cells induced by bFGF and EGF.Basic Clin Med(基礎醫學與臨床)，2013，33:444-449.

7 Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Sci，1999，284:143-147.

8 Yan H，Yu C.Repair of full-thickness cartilage defects with cells of different origin in a rabbit model.Arthroscopy:J Arthroscopic Related Surgery，2007，23:178-187.

9 Francis-West PH，Abdelfattah A，Chen P，et al.Mechanisms of GDF-5 action during skeletal development.Development，1999，126:1305-1315.

10 Jin L，Li X.Growth differentiation factor 5 regulation in bone regeneration.Curr Pharm Design，2013，19:3364-3373.

11 Pradhan D，Sharon M，Kumar M，et al.Synthesis of beaded and entwined carbon nanofibers in Ni:Al alloy catalyst.J Nanosci Nanotechnol，2007，7:1034-1038.

12 Guo B.Determination of flavonoids and quality evaluation of Sagittate Epimedium(Epimedium sagittatum).Chin Tradit Herbal Drugs，1996，27:584-585.

13 Zhang L，Zhang X，Li KF，et al.Icariin promotes extracellu-lar matrix synthesis and gene expression of chondrocytes in vitro.Phytother Res，2012，26:1385-1392.

14 Zhu S，Wang Z，Li Z，et al.Icaritin suppresses multiple myeloma，by inhibiting IL-6/JAK2/STAT3.Oncotarget，2015，6:10460-10472.

15 He L，Wang W.A study on the effect of icaritin on rat chondrocytes.J Central South Univ，Med Sci，2015，40:517-521

16 Venkatesan JK，Ekici M，Madry H，et al.SOX9 gene transfer via safe，stable，replication-defective recombinant adeno-associated virus vectors as a novel，powerful tool to enhance the chondrogenic potential of human mesenchymal stem cells.Stem Cell Res Ther，2012，3(3):22-37.

17 Chen SH，Lei M，Xie XH，et al.PLGA/TCP composite scaffold incorporating bioactive phytomolecule icaritin for enhancement of bone defect repair in rabbits.Acta Biomater，2013，9:6711-6722.