PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路在6-姜酚保護PC12 細胞對抗β 淀粉樣蛋白誘導細胞凋亡的作用

曾高峰，宗少暉，傅松文，農夢妮，李柯柯，嚴芳娜

1 廣西醫科大學公共衛生學院;2 廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱骨病外科;3廣西醫科大學研究生學院，南寧 530021

已有的研究表明，阿爾茨海默病發病過程中的神經退行性改變與β 淀粉樣蛋白的過量分泌密切相關［1］。體內實驗顯示，大鼠腦室內注射入Aβ 后，表現出認知功能、記憶功能降低等AD 樣癥狀及神經元細胞凋亡等［2］。因而，抑制Aβ 誘導的神經元變性可能對AD 的防治具有重要作用。此外，大量的研究顯示Aβ 引起的神經毒性作用與PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路密切相關［3，4］。故逆轉Aβ 通過PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路導致的細胞毒性，可能成為防治AD 的途徑之一。研究顯示，6-姜酚可減輕Aβ 誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡，因而可能具有神經保護作用［5］。然而，6-姜酚對AD 的防治作用尚未清楚，本研究旨在觀察6-姜酚在Aβ1-42導致的PC12 細胞凋亡中的作用及其分子信號通路基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

β 淀粉樣蛋白(1-42)(武漢明皓生物科技股份有限公司)，6-姜酚(上海撫生實業有限公司)，F12K培養基(武漢博士德)，神經生長因子(NGF，美國Millipore 公司)，馬血清(美國Gibco 公司)，胎牛血清(美國Gibco 公司)，噻唑蘭(MTT，Amresco 公司)，Akt、p-Akt(Ser473)、GSK-3β 及 p-GSK-3β(Ser9)抗體均購自于美國CST 公司，未分化PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 PC12 細胞的培養

PC12 細胞接種于含10% 馬血清、5% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的F12K培養基中，并置于37 ℃培養箱中培養，每2～3 d 換液一次。

1.3 MTT 法檢測PC12 細胞的存活率

PC12 細胞接種于96 孔板，經NGF 誘導分化5 d 后，分別加入5、10 及20 μM Aβ1-42作用24、48 及72 h，MTT 實驗分別檢測不同濃度Aβ1-42對PC12 細胞作用24、48 及72 h 的細胞存活率;PC12 細胞中分別加入40、80、120、200 及300 μM 的6-姜酚作用4 h 后，加入10 μM Aβ1-42繼續培養48 h，MTT 實驗檢測細胞存活率，以觀察6-姜酚對Aβ1-42所致的PC12 細胞凋亡的影響。具體步驟為，藥物作用結束后，每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT 并置于37 ℃培養箱中孵育4 h，然后棄去反應后的上清液，加入150 μL DMSO 后置于振蕩器上振蕩10 min，紫色結晶完全溶解后，酶標儀570 nm 波長測吸光度。

1.4 Western blot 分析

藥物作用結束后，離心收集PC12 細胞，以PBS漂洗2 遍后，加入RIPA 裂解液并置于冰上以將細胞充分裂解，離心收集上清液，采用BCA 法定量蛋白濃度。蛋白經變性后，以8% SDS-PAGE 進行電泳，蛋白經電泳分離后，采用濕轉法將蛋白轉移至硝酸纖維膜上。在室溫下，以5% BSA 封閉1 h 后，分別加入GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、Akt 及p-Akt 抗體并置于4 ℃，緩慢平搖孵育過夜。以TBST 進行漂洗4 遍后，加入辣根過氧化酶標記的二抗并于室溫下，緩慢平搖孵育1.5 h，再以TBST 進行漂洗4 遍，在暗房中以ECL 發光顯色劑對蛋白進行顯色，并采用Image J 軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.5 統計學方法

2 實驗結果

2.1 Aβ1-42對PC12 細胞存活率的影響

由圖1 可見，分別以5、10 及20 μM 濃度的Aβ1-42 對分化的PC12 細胞進行處理24、48 h 及72 h，各時間組的細胞存活率，隨著Aβ1-42濃度的增加而下降，且10、20 μM 組細胞存活率顯著下降(P＜0.05);Aβ1-42處理組細胞存活率隨著作用時間延長而下降，與作用24 h 相比，48、72 h 各濃度組細胞存活率均顯著降低(P＜0.05)。

圖1 Aβ1-42對PC12 細胞存活率的影響Fig.1 The effect of Aβ1-42on PC12 cell viability

2.2 6-姜酚對Aβ1-42致PC12 細胞凋亡的抑制作用

如表1 所示，與對照組相比，10 μM Aβ1-42對PC12 細胞進行作用48 h 后的細胞存活率顯著下降，而以80、120 及200 μM 的6-姜酚對PC12 細胞進行預處理4 h 后再加入Aβ1-42(10 μM)繼續培養48 h 的細胞存活率則較Aβ1-42處理組顯著上升(如表2 所示)。表明6-姜酚在80、120、200 μM 時均能顯著減少Aβ1-42引起的細胞凋亡，并且120 μM 的6-姜酚作用最明顯;但當濃度達300 μM 時，則可加重細胞凋亡。

表1 6-姜酚對Aβ1-42致PC12 細胞凋亡的抑制作用(±S)Table 1 The inhibitory effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced apoptosis in PC12 cells(±S)

表1 6-姜酚對Aβ1-42致PC12 細胞凋亡的抑制作用(±S)Table 1 The inhibitory effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced apoptosis in PC12 cells(±S)

注:與對照組比較，* P＜0.05，與Aβ1-42處理組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with the control group，* P＜0.05;Compared with the Aβ1-42treatment group，▲P＜0.05.

2.3 6-姜酚對Aβ1-42誘導的GSK-3β、Akt 磷酸化水平的影響

為了觀察PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路在6-姜酚保護PC12 細胞對抗Aβ1-42引起的細胞毒性的作用，以80、120 及200 μM 6-姜酚對PC12 細胞進行預處理4 h 后，再加入Aβ1-42(10 μM)繼續培養48 h，采用蛋白免疫印跡法檢測PC12 細胞中GSK-3β、p-GSK-3β、Akt 及p-Akt 的表達水平。結果顯示(圖2、圖3):10 μM Aβ1-42處理組中PC12 細胞的GSK-3β磷酸化水平較對照組顯著降低，而80 及120 μM 的6-姜酚預處理組中GSK-3β 的磷酸化水平則顯著高于Aβ1-42處理組的;以10 μM Aβ1-42對PC12 細胞進行作用48 h 后的Akt 磷酸化水平較對照組顯著降低，而以80 及120 μM 的6-姜酚對PC12 細胞進行預處理4 h 后再加入Aβ1-42(10 μM)繼續培養48 h 的PC12 細胞的Akt 磷酸化水平則顯著高于Aβ1-42處理組的。

圖2 6-姜酚對Aβ1-42誘導的GSK-3β 磷酸化水平的影響Fig.2 Effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced activation of GSK-3β

圖3 6-姜酚對Aβ1-42誘導的Akt 磷酸化水平的影響Fig.3 Effect of 6-gingerol on Aβ1-42-induced activation of Akt

3 討論與結論

體內研究表明，Aβ1-42可致大鼠神經發生退行性改變［6］。本研究結果顯示，PC12 細胞的存活率隨著Aβ1-42濃度的增加及作用時間的延長而下降，且10及20 μM Aβ1-42組在作用24、48 及72 h 后的細胞存活率均較對照組顯著下降(P＜0.05);與作用24 h相比，48 h 及72 h 各濃度組細胞存活率均顯著降低。因而Aβ1-42可誘導PC12 細胞發生凋亡，導致細胞存活率下降，這與以往的研究結果一致［7，8］。而6-姜酚在80、120、200 μM 時均能顯著減少Aβ1-42引起的細胞凋亡，并且在120 μM 時抑制效果最明顯;但當濃度達300 μM 時，則可加重細胞凋亡。結果表明，6-姜酚在80～200 μM 的濃度范圍內，通過對Aβ1-42所致細胞凋亡的抑制作用，表明6-姜酚對Aβ1-42所致的細胞凋亡具有保護作用，但高濃度的6-姜酚(300 μM)則具有毒性作用［9，10］。

AD 的發生與GSK-3β 密切相關。研究表明，tau蛋白的異常磷酸化通過神經毒性作用介導神經退行性疾病的發生，如AD［11，12］，而GSK-3β 的活化可引起tau 蛋白的磷酸化水平異常增高［13］。此外，GSK-3β 的活化可導致細胞凋亡及酶的失活［14］，而GSK-3β 的磷酸化水平增高可抑制GSK-3β 的活性［15］。本研究發現，PC12 細胞經Aβ1-42作用48 h 后，GSK-3β 的磷酸化水平較正常組顯著降低，表明Aβ1-42可激活GSK-3β 的活性。以80 及120 μM 的6-姜酚對PC12 細胞進行預處理4 h 后再加入Aβ1-42(10 μM)繼續培養48 h 的PC12 細胞的GSK-3β 磷酸化水平則顯著高于Aβ1-42處理組的，這表明6-姜酚可抑制由Aβ1-42激活的GSK-3β 活性。因而，6-姜酚對Aβ1-42誘導細胞凋亡的保護作用可能與其抑制GSK-3β 的活性有關。

通過PI3K 通道，Akt 在Ser473 位點發生磷酸化，介導了Akt 的激活［16］，從而具有神經保護作用［17］。研究表明，抑制PI3K/Akt 通道可顯著增加GSK-3β 的活性，導致tau 蛋白過度磷酸化［18］，從而與AD 的發生密切相關。而Akt 的激活，可以抑制GSK-3β 的活性［19］。本研究結果顯示，Aβ1-42處理組中PC12 細胞的Akt 磷酸化水平較對照組顯著降低，而80 及120 μM 6-姜酚預處理組中Akt 的磷酸化水平則顯著高于Aβ1-42處理組的，表明Aβ1-42可抑制PC12 細胞的Akt 活性，而6-姜酚可顯著抑制Aβ1-42導致的Akt 活性的下降。因而6-姜酚對Aβ1-42誘導細胞凋亡的保護作用可能與其激活Akt 的活性有關。

總之，本研究表明，6-姜酚可能通過PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路保護PC12 細胞對抗Aβ1-42誘導的細胞凋亡。

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