低位直腸癌淋巴結轉移動物模型的建立及其 E- 鈣黏蛋白的表達

艾斯克爾·吐拉洪 陳 凱 鄧大偉▲

1.新疆醫科大學第一附屬醫院腫瘤中心，新疆烏魯木齊 830000；

2.新疆醫科大學第五附屬醫院普外科，烏魯木齊 830000

低位直腸癌淋巴結轉移動物模型的建立及其 E- 鈣黏蛋白的表達

艾斯克爾·吐拉洪1陳 凱2鄧大偉2▲

1.新疆醫科大學第一附屬醫院腫瘤中心，新疆烏魯木齊 830000；

2.新疆醫科大學第五附屬醫院普外科，烏魯木齊 830000

目的建立裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型，檢測 E-鈣黏蛋白在裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型中的表達，探討其在直腸癌淋巴結轉移過程中的作用。方法取對數生長期的人大腸癌細胞株 SW480 接種于裸鼠直腸黏膜下，建立裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型。 按隨機數字表法分為三組：直腸癌模型組（A 組，40 只，二甲基肼注射+SW480 種植）、二甲基肼對照組（B 組，40 只，二甲基肼注射）和空白對照組（C 組，40 只，不作任何處理）。 處死裸鼠，光鏡下觀察種植瘤組織和淋巴結轉移情況，并采用免疫組化法檢測種植瘤組織和轉移淋巴結組織中 E-鈣黏蛋白表達水平。結果A 組裸鼠約 1 周時成瘤率為 100%，之后瘤結節逐漸長大。 B 組和 C 組裸鼠均未成瘤。A 組裸鼠的腫瘤組織中 E-鈣黏蛋白陽性表達率（40.0%）明顯低于腫瘤周邊組織（82.5%），差異有統計學意義（χ2= 7.24，P＜ 0.05）。 B 組裸鼠的直腸黏膜組織中 E-鈣黏蛋白陽性表達率為 80.0%，C 組裸鼠的直腸黏膜組織中 E-鈣黏蛋白陽性表達率為 85.0%，A 組腫瘤組織以及 B 組、C 組三組比較差異有統計學意義 （χ2=5.18，P＜ 0.05），A 組的 E-鈣黏蛋白陽性表達率明顯低于 B 組和 C 組（χ2=8.12、9.04，P＜ 0.05）。 發生側方淋巴結轉移的 A 組裸鼠種植瘤組織中 E-鈣黏蛋白陽性表達率為 33.3%，明顯低于未發生側方淋巴結轉移的裸鼠種植瘤組織（100.0%），差異有統計學意義（χ2=10.28，P＜ 0.05）。結論二甲基肼預處理后進行人大腸癌細胞株 SW480 接種制模法成功構建了裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型。 E-鈣黏蛋白表達減弱可能在直腸癌發生、侵襲及淋巴結轉移演進過程中起著重要作用。

直腸癌；淋巴結轉移；E-鈣黏蛋白；裸鼠

直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在新疆少數民族中的發病率逐年升高。 目前手術切除是治療直腸癌的最有效的手段，而淋巴結轉移是導致患者術后復發和死亡的重要原因，也是術后病情轉歸的重要觀測指標[1]。 影響直腸癌淋巴結轉移的因素與多種蛋白分子相關，其中 E-鈣黏蛋白是直腸癌轉移的重要因素，影響腫瘤生長速度、腫瘤大小、浸潤深度及癌細胞遠處轉移[2]。 本研究選用人大腸癌細胞株SW480 建立低位直腸癌淋巴結轉移模型，旨在探討 E-鈣黏蛋白在直腸癌淋巴結轉移過程中的作用機制。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 實驗動物及分組 BALB/Cnu/nu 雄性裸鼠120只，SPF 級，購自新疆醫科大學動物實驗研究中心（合格證號：SCHK2014-0007），鼠齡 6～8 周，體重 18～22 g，分籠飼養于屏障系統的潔凈層流架內，室溫控制在（25±1）℃，相對濕度 40%～50%。 按隨機數字表法將其分為三組：直腸癌模型組 （A 組，40 只 ，二甲基肼注射+SW480 種植）、二甲基肼對照組（B 組，40 只，二甲基肼注射）和空白對照組（C 組，40 只，不作任何處理）。

1.1.2 細胞來源 人大腸癌細胞株 SW480，由中科院上海細胞生物研究所提供，培養于含 10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基，置 37℃ 5%CO2培養箱內培養。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶購自 Sigma 公司，RPMII64O 培養基購自 GiBco 公司，鼠抗人 E-鈣黏蛋白單克隆抗體購自 Dako 公司，SP 免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人大腸癌細胞株 SW480 的培養 采用含 10% FBS的 RPMI-1640 培養基培養，置 37℃、5%CO2培養箱內培養，取生存狀態良好的細胞，用 0.25%胰酶消化后收集，以錐蟲藍檢測細胞活性大于 90%，加適量不含血清的 RPMI-1640 營養液配制成濃度為 1×106個/mL的懸液備用。

1.2.2 裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型的建立 將二甲基肼用生理鹽水配成 1%溶液，用 4%NaOH 溶液調成 pH 值為 6.5～7.0，抽濾除菌，對 A 組和 B 組裸鼠的頸部皮下進行注射，30 mg/kg，1 次/周， 每周測體重 1次，據體重調整劑量，至第 8 周末。 B 組裸鼠分籠飼養。 A 組裸鼠術前禁食 12 h， 采用 10%水合氯 醛（0.3 mL∶100 g）腹腔內注射麻醉藥，消毒會陰肛門直腸腔，采用外翻肛門直腸技術將直腸黏膜外翻顯露于擴張的肛門口外， 取大腸癌細胞株 SW480 懸液 0.2 mL 緩慢注射接種于背側肛門緣上 2 mm 直腸黏膜下。 術畢觀察無活動性出血。 術后所有裸鼠暫時分籠飼養直至完全清醒，再禁食禁水 6 h 后給予高能量飲食。 C 組不作任何處理。

1.2.3 制模后成瘤及浸潤生長情況的觀察 三組動物均以戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔麻醉，分別于 1、2、4、6 周觀測動物 1 次，通過頸部脫臼法處死裸鼠各 10 只，開腹觀察成瘤及淋巴結轉移情況。 測量瘤塊長度（a）和寬度（b），計算腫瘤體積（V）=ab2/2。 切取 A 組裸鼠的腫瘤段組織及周圍組織（包括側方淋巴組織），切取 B 組和 C 組裸鼠的直腸及周圍組織（包括側方淋巴組織）。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色 將切除的標本均浸于10%福爾馬林中，常規石蠟包埋，連續切片，厚度 4 μm，分別進行 HE 染色，光學顯微鏡下觀察組織結構變化。

1.2.5 免疫組化檢測 E-鈣黏蛋白表達水平 將切除的標本浸于 10%福爾馬林中，常規石蠟包埋，制作石蠟切片。石蠟切片常規脫蠟至水，熱抗原修復。一抗孵育4℃過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗 3 次，二抗 37℃孵育 30 min，再次 PBS 沖洗 3 次。 加新鮮配制的二氨基聯苯胺（DAB）0.01 mol/L 顯色，PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.2.6 結果判讀 利用 BX41TF 光學顯微鏡進行采圖，以細胞膜及細胞漿內出現顆粒作為陽性細胞，每張切片隨機選取 5 個高倍視野，每個視野計數 100 個腫瘤細胞，共計 500 個細胞，由 3 名病理醫師獨立計數。 按陽性細胞所占百分比評分：陰性為 0 分，陽性細胞率延 10%為 1 分，＞10%～50%為 2 分，＞50%～75%為 3 分，＞75%為 4 分；按染色強度分 3 級：棕黃色為 3 分，黃色為 2 分，淡黃色為 1 分，無色為 0 分。 陽性細胞數得分與染色強度得分相加≥5 分為陽性 （+），＜3 分為陰性（-）。 染色結果由 3 名以上病理研究者進行判斷。

1.3 統計學方法

采用 SPSS 13.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用 χ2檢驗，以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 制模后成瘤及浸潤生長情況

A 組裸鼠經二甲基肼預處理后進行人大腸癌細胞株 SW480 接種制模，約 1 周時可見直腸壁內小結節形成，成瘤率 100%，之后瘤結節逐漸長大，腫瘤體積測量結果見表 1。 6 周時，6 只裸鼠均發現瘤體浸潤腸外，均可見側方淋巴結轉移浸潤。 B 組和 C 組裸鼠均未成瘤。

表1 A 組裸鼠不同接種時間腫瘤體積變化

表1 A 組裸鼠不同接種時間腫瘤體積變化

接種時間 只數 腫瘤體積（mm3）1周2周4周6周10 10 10 10 16.52±2.85 29.46±12.63 86.57±19.58 157.9±20.59

2.2 種植瘤及側方淋巴結的病理組織學檢查

A 組種植瘤組織鏡下表現為低分化腺癌，癌細胞多呈圓形，橢圓形，核大，深染，異形，核分裂象多見；癌組織排列呈團狀或索狀，可見一些腺體結構存在，并浸潤腸壁各層。 見圖 1（封四）。 A 組裸鼠中發生轉移的側方淋巴結組織，鏡下見轉移灶癌組織與直腸種植瘤組織的形態結構十分相似。 見圖 2（封四）。

2.3 三組裸鼠中 E-鈣黏蛋白表達檢測結果

免疫組化檢測三組裸鼠中 E-鈣黏蛋白表達情況，三組 E-鈣黏蛋白陽性表達率比較，差異有統計學意義（χ2=5.18，P＜ 0.05）。 A 組裸鼠的腫瘤組織 E-鈣黏蛋白陽性表達率明顯低于腫瘤周邊組織（χ2=7.24，P＜ 0.05）；A 組腫瘤組織 E-鈣黏蛋白陽性表達率明顯低于 B 組和 C 組，差異均有統計學意義（χ2=8.12、9.04，均P＜ 0.05）。 見圖 3（封四）、表 2。

接種 6 周時，A 組裸鼠中有 6 例發現側方淋巴結轉移，與其余未發現轉移的 4 例比較，發現側方淋巴結轉移的裸鼠種植瘤組織中 E-鈣黏蛋白陽性表達率明顯低于未發現側方淋巴結轉移的裸鼠種植瘤組織，差異有統計學意義（χ2=10.28，P＜ 0.05）。 見表 3。

表2 三組裸鼠中 E-鈣黏蛋白表達比較[n（%）]

表3 發生和未發生側方淋巴結轉移的 A 組裸鼠種植瘤組織中E-鈣黏蛋白表達比較[n（%）]

3 討論

直腸癌是消化系統比較常見的惡性腫瘤，治療失敗的主要原因在于腫瘤的復發與轉移，因此深入研究人直腸癌發病、轉移浸潤機制及抗轉移治療方法已經成為目前的主要任務之一，這就要求必須建立最能體現人體直腸癌特點的動物模型，為結腸癌轉移機制和抗轉移治療的研究提供理想的動物模型[3]。 以往研究較多的是人直腸癌皮下移植瘤動物模型，該模型建立容易、觀察方便，但由于皮下移植瘤動物模型無法模擬人類直腸腫瘤發病的臨床條件以及常見的一些 惡性生物學特性，比如肝轉移、淋巴結轉移等，因此在腫瘤的治療研究方面、特別是治療機制研究方面的價值較小[4-7]。 原位移植模型是將癌細胞懸液注射法和癌組織植塊法通過手術種植在體內的相應部位，從而進行相應部位腫瘤研究的方法，其腫瘤的生物學特性與在體腫瘤較為一致[8-9]。 目前國內研究人直腸癌的原位移植瘤模型較少，因此，為了進一步尋找理想的原位 模型，本實驗采用二甲基肼預處理裸鼠，進一步減低免疫性 ，將人結腸癌細胞株 HCT-116 細胞注射接種 于裸鼠直腸黏膜下，從而模擬直腸癌臨床發生 、發展演變過程，旨在為大腸癌浸潤轉移機制和抗轉移治療提供穩定、理想的動物模型。

本實驗采取不同時間取材著重觀察了原位癌腫的生物學特性和轉移規律發現：A 組裸鼠經二甲基肼預處理后進行人大腸癌細胞株 SW480 接種制 模 ，約1 周時可見直腸壁內小結節形成，成瘤率為 100%，之后瘤結節逐漸長大。 在直腸黏膜植入腫塊后，癌細胞局部形成腫瘤，隨著接種時間延長，瘤體逐漸增大。 繼之 6 周時，6 只裸 鼠均發現瘤 體浸潤至 腸 外，均可 見側方淋巴結轉移浸潤。 本實驗顯示，二甲基肼預處理后進行人大腸癌細胞株 SW480 接種制模法成功構建了裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型，客觀地模擬了臨床直腸 癌 患者體內增殖生長、側方淋巴結轉移的過程，操作簡單，成瘤時間短，轉移率高，制模穩定。 這為進一步研究直腸癌轉移機制、抗轉移治療提供了一種較理想的動物模型。

目前手術切除是治療直腸癌最有效的手段，而淋巴結轉移是導致患者術后復發和死亡的重要原因，也是術后病情轉歸的重要觀測指標。 直腸癌的淋巴結轉移主要以上方為主，側方淋巴結的轉移是在上方通路阻塞的情況下才會發生，如果側方淋巴結受浸，則表示疾病已屬晚期。 臨床上發現行側方淋巴結清掃的患者腫瘤復發及轉移的時間隔長于淋巴結未清掃者。 影響直腸癌淋巴結轉移的因素與多種蛋白分子相關，其中腫瘤細胞獲取高侵襲性的關鍵是 E-鈣黏附蛋白黏附功能喪失[10-11]。 目前國際上并沒有標準 E 鈣黏蛋白與腫瘤轉移相關性研究。 本實驗在成功建立裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型的基礎上，通過免疫組織化學法檢測了 E 鈣黏蛋白在裸鼠種植瘤組織及相關鄰近組織中的表達水平，初步評詁了側方淋巴結轉移的發生與 E 鈣黏蛋白關系。 研究結果發現，免疫組化檢測三組裸鼠中 E-鈣黏蛋白表達情況，A 組裸 鼠 的腫瘤組織中 E-鈣黏蛋白陽性表達率為 40.0%（16/40），腫瘤周邊組織中 E-鈣黏蛋白陽性表達率為 82.5%（33/40），腫瘤組織中 E-鈣黏蛋白陽性表達率明顯低于腫瘤周邊組織（P＜ 0.05），且 A 組的 E-鈣黏蛋白陽性表達率也明顯低于 B 組和 C 組（P＜ 0.05）。提示 E-鈣黏蛋白作為細胞 之 間的鈣依賴 性 跨膜糖蛋 白 ，在腫瘤的 發生、生長過程中扮演著重要的角色，在直腸癌細胞的分化、增殖的環節中發揮著重要的生物學效應。

目前發現，E-鈣黏蛋白表達的缺失是上皮-間質轉化（EMT）過程中關鍵的一步，腫瘤細胞將其表型從上皮細胞轉為間質細胞，從而獲得侵襲性和游走遷移能力[12-13]。 本組研究中也發現，接種 6 周時，A 組裸鼠中有 6 例發現側方淋巴結轉移，與其余未發現轉移的4 例比較，發現側方淋巴結轉移的裸鼠種植瘤組織中E-鈣黏蛋白陽性表達率為 33.3%（2/6），明顯低于未發現側方淋巴結轉移的裸鼠種植瘤組織中的 E-鈣黏蛋白陽性表達率（100.0%，4/4），差異有統計學意義（P＜0.05）。 提示 E-鈣黏蛋白介導的黏附系統在腫瘤的浸潤轉移中可能起著重要作用。 E-鈣黏蛋白表達的減弱或缺失，導致腫瘤細胞間黏附性降低，誘導 EMT 發生，可促進腫瘤細胞獲得侵襲和轉移的能力，進 而促進了腫瘤的浸潤及淋巴結轉移[14]，但其具體作用機制還不十分清楚，仍有待于進一步研究。

[1] Razavi R，Harrison LE. Thermal sensitization using induced oxidativestress decreases tumor growth in an invivo model of hyperthermic intraperitoneal pefusion [J]. Ann Surg Oncol，2010，17（1）：304-311.

[2] 霍西茜，王寧.鈣粘素蛋白-E 與腫瘤發生及生物學行為相關性的研究進展[J].現代腫瘤醫學，2013，21（8）：1879-1882.

[3] 陳衛東，付文政，馬東旺.結直腸癌動物模型建立的研究進展[J].現代中西醫結合雜志，2010，19（33）：4374-4376.

[4] 蔡健華，趙任，萬方軍，等.裸鼠原位種植大腸癌轉移種建模方法的比較[J].中華實驗外科雜志，2010，27（6）：837-839.

[5] 江澤，許華，李勝水，等.MTT 法檢測乳腺癌細胞對化療藥物敏感性的研究[J].中國醫藥導報，2010，7（3）：34-35.

[6] 王志華.細胞因子誘導的殺傷細胞治療癌癥的基礎與臨床[J].中國醫藥導報，2013，10（7）：10-14.

[7] Donigan M，Norcross LS，Aversal J，et al. Novel murine model for colon cancer：non -operative trans -anal rectal injection [J]. J Surg Res，2009，154（2）：299-303.

[8] 戴功建，金黑鷹，夏建國.裸鼠結直腸癌原位移植模型的建立 和應 用 進展 [J].實 用臨 床 醫藥 雜 志 ，2010，14 （5）：119-121.

[9] Donigan M，Loh BD，Norcross LS，et al. A metastatic colon cancer moldelusing nonperative transanalrectalinjection [J]. Surg Endosc，2010，24（3）：642-647.

[10] 娜仁 ，談順，饒翔 ，等.P120 和 E-cad 在乳腺癌 中的表達及鑒別診斷意義[J].中國婦幼保健，2012，27（6）：896-899.

[11] 肖帥，裘正軍，黃陳，等.轉錄因子 Snail及黏附分子 E-cadherin 在直腸癌中的表達及意義[J].國際外科學雜志，ISTIC，2010，37 （8）：514-519.

[12] Bezdekova M，Brychtova S，Sedlakova E，et al. Analysis of snail-1，e-cadherin and claudin-1 expression in colorectal adenomas and carcinomas [J]. Inter J Mole Sci，2012，13（2）：1632-1643.

[13] 張莉，沈麗佳，,謝思明，等.影響 E-鈣黏蛋白表達下調因素與上皮-間充質轉化關系的研究進展[J].中外醫學研究，2014，14（10）：158-160.

[14] 張偉，李芳，張飛燕，等.基質金屬蛋白酶-7、上皮性鈣黏附蛋白和血管內 皮生長因子 在乳腺癌中 表達及意義的研究[J].中國醫藥導報，2012，9（18）：77-80.

Establishment of animal model of low rectal cancer lymph node metastasis and expression of E-calcium

Aishikeer·Tulahong1CHEN Kai2DENG Dawei2▲
1.Cancer Center, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, U-rumqi 830000, China; 2.Department of General Surgery, the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830000,China

ObjectiveTo establish a nude mice low rectal cancer lymph node metastasis model and to detect the expression of E-calcium in low rectal cancer lymph node metastasis in nude mice model, to discusse its role in the process of rectal cancer lymph node metastasis.MethodsTo establish a nude mice model of low rectal cancer lymph node metastasis by using people's congress colon cancer cell line SW480.There were three groups according to random number table method: colorectal cancer model groups (group A,40 cases,dimethyl hydrazine injection + SW480 planting), dimethyl hydrazine in the control group (group B, 40 cases, dimethyl hydrazine injection) and blank control group (group C, 40 cases, do not make any processing). After Executing nude mice, the growth of tumor tissue and lymph node metastasis were observed, and the expression levels of E-calcium protein in tumor tissues and metastasis lymph node tissues were detected using immunohistochemical method.ResultsThe rate of nude mice tumor of group A was 100% about 1 week, after tumor nodules gradually grew up. Group B and group C had no tumor. The positive expression rate of E-calcium protein in tumor tissues of group A was 40.0%, was significantly lower than that in the tumor surrounding tissues of group A (82.5%),the difference was statistically significant (χ2=7.24,P＜ 0.05). The positive expression rate of E-calcium protein in rectal mucosa tissues of group B was 80.0% and the positive expression rate of E-calcium protein in rectal mucosa tissues of group C was 85.0%. Comparison between tumor tissues of group A and group B,group C,the difference was statisticallysignificant (χ2=5.18,P＜ 0.05), the positive expression rate of E-calcium in group A was lower than that in group B and group C, the differences were statistically significant (χ2=8.12, 9.04,P＜ 0.05). The positive expression rate of E-calcium protein in tumor tissue of nude mice with lateral lymph node metastasis was 33.3% , was significantly lower than that in tumor tissue of nude mice without lateral lymph node metastasis (100.0%), the difference was statistically significant (χ2=10.28,P＜ 0.05).ConclusionThe nude mice model for low rectal cancer lymph node metastasis is successfully build by dimethyl hydrazine pedestrians colorectal cancer cell line SW480 vaccination moulding method. The lower expression of E -calcium protein may play an important role in the process of occurrence, invasion and lymph node metastasis in colorectal cancer.

Rectal cancer;Lymph node metastasis; E-calcium; Nude mice

R735.3

A

1673-7210（2015）08（b）-0017-04

2015-02-13 本文編輯：任 念）

新疆維吾爾自治區自然科學基 金項 目（2014211 C131）。

▲通訊作者