尼莫地平對小鼠肝部分切除術后認知功能的影響與機制研究

張珣 湯穎 李婉 張榮偉中國醫科大學附屬第一醫：老年神經內科，遼寧沈陽110001

尼莫地平對小鼠肝部分切除術后認知功能的影響與機制研究

張珣 湯穎 李婉 張榮偉▲
中國醫科大學附屬第一醫：老年神經內科，遼寧沈陽110001

目的探討尼莫地平對小鼠肝部分切除術后認知功能損傷的保護作用及作用機制。方法將36只18～20月齡健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為三組：對照組（C組，n=12），不做任何特殊處理；手術組（S組，n=12），小鼠在麻醉后行肝部分切除術；尼莫地平組（Nimo組，n=12），手術與S組相同，并于術前1 d開始腹腔注射尼莫地平。每組于術后3 d處死實驗小鼠，迅速獲取海馬組織。T迷宮實驗檢測實驗小鼠術后3 d的學習和記憶能力；Nissel染色及透射電鏡觀察實驗小鼠海馬神經元存活的數量及超微結構改變；免疫組織化學方法檢測實驗小鼠海馬Fas和FasL的蛋白表達。結果與C組比較，S組小鼠認知功能術后3 d明顯下降（P＜0.05）；與S組比較，Nimo組可改善小鼠術后3 d的認知功能（P＜0.05）。Nissel染色可見Nimo組術后3 d小鼠海馬神經元存活數量較S組明顯增多；透射電鏡下可見Nimo組術后3 d小鼠海馬組織的超微結構改變較S組明顯減輕。Nimo組術后3 d小鼠海馬組織Fas和FasL表達較S組減少（P＜0.01）。結論尼莫地平可通過抑制Fas/FasL介導的海馬神經元凋亡而改善老齡小鼠的術后認知功能。

尼莫地平曰肝部分切除術曰認知功能曰Fas曰FasL

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是老年人的常見術后并發癥之一，主要表現為認知功能受損，包括學習能力和記憶能力的下降、意識和信息處理的障礙等中樞神經系統功能障礙，嚴重者可以出現癡呆［1-2］。研究顯示，25%～50%的?。夯颊咴谛g后會發生認知功能的改變［3-4］，同時大約40%的患者在術后5年仍會有認知受損的表現［5］。目前認為老齡是唯一明確的POCD的危險因素，手術創傷可能是主要的原因［6］。通過研究發現老齡鼠腦內存在腦神經元大量凋亡的現象，而這種神經細胞數量的減少可能是引起腦老化性認知功能障礙的重要原因。同時研究已經證實細胞凋亡是包括阿爾茨海默?。ˋD）在內的多種神經退行性疾病的一個共同的病理特征［7-8］。但細胞凋亡機制是否與POCD相關還有待于進一步研究。本研究模擬臨床手術過程，通過對老年小鼠行肝部分切除術，觀察手術創傷所致老齡小鼠認知功能的下降與海馬神經元凋亡的關系及尼莫地平的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選擇健康的18～20月齡C57BL雌性老齡小鼠，許可證號XC-XK（京）2012-0001，購自北京維通利華公司。實驗過程符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》及倫理要求。將小鼠隨機分為3組：對照組（C組）、手術組（S組）和尼莫地平組（Nimo組），每組各12只。C組小鼠不做任何特殊處理，S組小鼠在麻醉后行肝部分切除術，Nimo組小鼠手術與S組相同，于術前1 d開始腹腔注射尼莫地平（拜耳公司生產，批號：國藥準字J20100002，50 mL/10 mg）0.2 mg/（kg·d），每日1次。

1.2 手術模型建立

肝部分切除術具體步驟：10%水合氯醛麻醉后，手術切口處備皮，消毒，上腹部正中做一小切口，游離切除左側部分肝臟，用75%酒精棉球壓迫止血，傷口用0.25%布比卡因浸潤止痛，用縫線縫合傷口，并予以抗生素敷于傷口，所有手術步驟均為無菌操作。后將老鼠移至溫箱蘇醒，蘇醒后放回籠子中各自飼養。

1.3 實驗動物的認知功能檢測

T迷宮檢測是在T字型的迷宮中尋找食物以檢測動物對食物的空間工作記憶情況。術后3 d行T迷宮檢測，實驗過程中，小鼠控制飲食，但可自由飲水。每只小鼠均予訓練5個實驗，每個實驗包括一個預備實驗與一個正式實驗。預備實驗將其中的一個臂關閉，允許小鼠進入來獲取食物，取食結束后，小鼠放回起始區，停留大約10 s之后，進行正式實驗測試。正式實驗時將起始臂和目標臂同時打開。若小鼠的選擇是未曾進入的臂，則為正確選擇，可獲得食物獎勵。若小鼠重復進入了相同的臂，為錯誤選擇，將不予以獎勵。實驗間隔為10 min。延長預備實驗和正式實驗間的時間間隔至90、180 s來測試，檢測術后3 d小鼠的空間工作記憶能力。

1.4 形態學觀察

術后第3天心臟灌注固定后處死動物，各組動物摘取雙側海馬，使用4%多聚甲醛及2.5%戊二醛固定，常規方法來制備石蠟及電鏡切片，進行Nissel染色，分別進行光鏡與電鏡的觀察。

1.5 免疫組化染色

對各組海馬組織凋亡相關蛋白Fas、FasL進行染色。Fas、FasL一抗為兔抗小鼠IgG，二抗為生物素標記的山羊抗兔IgG。染色法按免疫組化試劑盒說明進行操作。以胞漿出現棕黃色染色為陽性，染色陰性對照以PBS代替一抗。

1.6 統計學方法

應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據的分析處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間的比較采用Student t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尼莫地平對術后小鼠認知功能的影響（T迷宮）

通過檢測10、90、180 s的延緩間隔，結果發現術后3 d S組小鼠的正確率與C組比較明顯降低（P＜0.05）；而Nimo組小鼠的正確率與S組小鼠比較明顯改善（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組實驗動物的空間記憶能力變化（T迷宮）

2.2 尼莫地平對手術小鼠形態學的影響

Nissel染色結果可見術后3 d海馬區存活的神經元細胞數量減少，神經胞質顏色變淺，尼氏小體模糊、消散。Nimo組小鼠海馬區存活的神經元數量增多。電鏡下發現術后3 d的S組小鼠海馬神經元及膠質細胞有核固縮、核內染色質邊集、線粒體腫脹以及電子密度減低等改變，經過尼莫地平治療后，可見神經元及膠質細胞的形態相對完整，而且線粒體腫脹減輕。見圖2、3（封四）。

2.3 尼莫地平對手術小鼠海馬凋亡蛋白Fas/FasL表達的影響

與C組比較，術后3 d S組小鼠海馬Fas/FasL表達增加（P＜0.01），而與S組比較，Nimo組小鼠海馬Fas/FasL表達明顯降低（P＜0.01）。見圖4～6（圖4、5見封四）。

圖6 Fas/FasL免疫組化IOD值分析

3 討論

目前POCD的發病機制存在多種學說，研究發現，老年性癡呆Aβ學說和Tau蛋白磷酸化學說參與了POCD的發病［9］，推測POCD與AD可能存在相同的發病機制。細胞凋亡是AD的發病機制之一，然而，細胞凋亡與POCD的關系尚未見報道。

細胞凋亡是體內維持自身生理狀態相對穩定的重要調節機制之一，發生異常增加或減少均可導致組織器官的結構或功能改變。目前研究認為細胞凋亡主要有死亡受體途徑（外源性途徑）、線粒體途徑與內質網應激途徑（內源性途徑）［10］。本研究主要討論死亡受體途徑，Fas系統是一類與凋亡有關的基因，是位于細胞膜上的一個受體，屬于Ⅰ型膜蛋白，由胞外區、穿膜區、胞漿區組成，具有含2～5個半胱氨酸的細胞外重復序列與細胞內死亡區域（DD），DD是轉導細胞凋亡信號所不可或缺的，其對應物的死亡配體為FasL。受體與配體特異性結合可經死亡域傳導死亡信號從而介導細胞凋亡。

本實驗主要探討了手術創傷對老齡小鼠海馬區凋亡蛋白Fas/FasL的表達影響以及經尼莫地平治療后對術后認知功能的改善作用與機制，結果表明手術創傷可導致實驗鼠海馬區凋亡蛋白Fas/FasL表達的增加，而在給予尼莫地平治療后S組小鼠的認知功能明顯改善，海馬神經元損傷減輕，伴有海馬區Fas/ FasL表達的減少，因此，本實驗發現細胞凋亡可能參與了POCD的發病，而尼莫地平可能通過抑制細胞凋亡發揮對POCD的神經保護作用。

尼莫地平為1，4二氫喲啶衍生物，是繼維拉帕米、硝苯地平之后的第二代鈣通道阻滯劑，也廣泛用于治療腦血管病及認知障礙性疾病等。其半衰期為2 h，注射1 mg/kg后腦內濃度在15 min達高峰。電生理研究發現，尼莫地平可選擇性地與L型Ca2+通道結合，有較高的脂溶性，極易通過血腦屏障，在腦中較其他Ca2+通道阻滯劑有更大的容積分布及較強的受體親和力［11］。尼莫地平可降低細胞內鈣超載，減少氧自由基產生，改善缺血區腦循環，抑制細胞凋亡［12］。

本研究結果為POCD發病機制的研究及新的靶向治療奠定了理論基礎。

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Study on effects and mechanism of Nimodipine on cognitive function in partial hepatectomized mice

ZHANG XunTANG YingLI WanZHANG Rongwei▲
Department of Geriatric Neurology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Liaoning Province, Shenyang110001,China

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of Nimodipine on partial hepatectomized mice.MethodsThirty six healthy male C57BL/6 mice aged 18-20 months were randomly divided into 3 groups:control group(group C,n=12),without any special treatment;the surgery group(group S,n=12),with partial hepatectomy after anesthesia in mice;Nimodipine group(group Nimo,n=12),the mice in group Nimo and group S were in the same operation,intraperitoneal injection of Nimodipine was started 1 day before surgery,mice were sacrificed at 3 days after surgery in each group,and hippocampus were moved quickly.T-maze assay was used to detect the ability of learning and memory of the experimental mice 3 days after surgery;and Nissel staining and transmission electron microscopy was used to observe the change of hippocampal neuron survival quantity and ultrastructure in experimental mice;immunohistochemical method was used to detect the expression of Fas and FasL protein in the hippocampus of experimental mice.ResultsCompared with group C,the cognitive function of group S declined significantly on three days after surgery(P＜0.05);compared with the group S,group Nimo could improve the cognitive function on three days after surgery(P＜0.05).Nissel staining showed that the quantities of hippocampal neurons increased significantly on 3 days after surgery in group Nimo;the transmission electron microscopy showed there was a mild ultrastructure change of hippocampal tissues on three days after surgery in group Nimo.The expression of Fas and FasL in hippocampal tissues of mice in group Nimo showed a decrease on three days after surgery compared with group S(P＜0.01).ConclusionNimodipine can improve postoperative cognitive function by inhibiting the hippocampal neuron apoptosis mediated by Fas/FasL in aged mice.

Nimodipine;Partial hepatectomy;Cognitive function;Fas;FasL

R657

A

1673-7210（2015）07（a）-0004-03

2015-02-17本文編輯：張瑜杰）

國家自然科學基金資助項目（81100889）?！?/p>