湖南桃江病圃稻瘟病病菌遺傳多樣性的SS R分析

毛 銳，任佐華，劉 翔，倪蘭鳳，周 瑚，戴良英，劉二明

（1.湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128；2．植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

湖南桃江病圃稻瘟病病菌遺傳多樣性的SS R分析

毛 銳1,2，任佐華1,2，劉 翔1,2，倪蘭鳳1,2，周 瑚1,2，戴良英1,2，劉二明1,2

（1.湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128；2．植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

為了解湖南桃江病圃稻瘟病病菌遺傳多樣性，選用14對SS R引物，采用SS R標記技術分析了從該病圃中麗江新團黑谷（廣譜高感稻瘟病品種）上分離的89個稻瘟病菌單孢菌株的遺傳多樣性。結果表明，以相似系數0.72為界，將89個菌株劃分成20個遺傳譜系，其中L06和L07為優勢宗譜，分別含有18和13個菌株，各占總菌株數的20.2%和14.6%；有6個宗譜分別含4～7個菌株，共占總菌株數的34.8%，另12個宗譜分別含菌株1～3個，共占總菌株數的30.3%。該病圃中的稻瘟病菌群體復雜，遺傳多樣性豐富，湖南抗瘟品種選育和品種布局應針對L06和L07優勢宗譜。

病圃；稻瘟病菌；SS R；遺傳多樣性

稻瘟病是由Magnaporthe oryzae引起的一種重要的氣流傳播的災害性水稻真菌病害[1]，它嚴重影響水稻高產穩產，在發病嚴重的年份，減產在10%～50%，全球每年因稻瘟病導致水稻減產在11%～30%[2]。選育并種植抗病品種，是公認最直接有效的防治措施之一，但由于田間稻瘟病菌群體組織結構復雜，易變性或因無毒基因突變導致抗病品種在推廣3～5 a后抗病性喪失[3]，其引發病害的流行給生產帶來極大的危害[4]。因此，明確一個水稻種植區域的稻瘟病菌群體遺傳結構，對抗瘟水稻育種材料的發掘及抗瘟品種的利用和布局有重要的實踐意義。

近年來，SSR分子標記廣泛運用于抗稻瘟病遺傳多樣性的研究。譚清群等[5]對32份抗瘟病地方種質資源進行SSR遺傳多樣性分析，確立親緣關系的遠近與其地理來源有一定的相關性。涂敏等[6]用24對SSR引物對云南省160個水稻品種進行遺傳多樣性分析，證實云南省水稻品種的群體遺傳多樣性越高，群體對稻瘟病的抗性水平越高。李小湘等[7]用SSR分子標記方法對湖南不同來源地方種質136份材料進行分析，評價了湖南同（近）名地方稻的遺傳差異程度，為同（近）名地方稻種質資源的保存，供種以及重點利用種質遴選提供理論依據。前人對稻瘟病病圃遺傳多樣性的SSR分析主要集中于國內各區域性之間，而對湖南桃江地域性稻瘟病病圃系統研究較少，本研究利用SSR分子標記方法分析了2013年湖南桃江稻瘟病菌群體遺傳多樣性，旨在揭示該地區稻瘟病菌遺傳多樣性特征，為以后湖南水稻瘟品種的選育及抗瘟品種的利用提供必要的基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試菌株89個，是于2013年采自湖南桃江病圃感病品種麗江新團黑谷（LTH）上采集的葉瘟感病樣本，利用體式顯微鏡單孢分離法獲得89個單孢菌體。

1.2 菌株培養和DNA提取

將純化后的供試菌株菌絲接種到稻瘟病菌液體培養基中（葡萄糖20 g、酵母浸出液5 g、CaCl20.1 g、 KH2PO40.5 g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、水1000mL），于28℃、180 r/Min搖床上培養4～6 d，收集聚集成球的菌絲體，采用EasyPureGenomic DNA Kit試劑盒提取稻瘟病菌基因組DNA，并使用NanoDrop的Spectrophotometer檢測DNA濃度，調整到150 ng/uL，備用。

1.3 SSR引物

14對引物：KMS02、KMS20、SMS17、A5、D4、D5、G5、FG01、FG02、FG03、MS355、MS363、MS677、C3，引物由上海introgen公司合成（表1）。

1.4 PCR擴增體系及電泳

表1 14對SSR引物

PCR擴增反應體系的總體積為25μL，體系中含有正、反引物各1.25μL，11.5ML去離子水，10μL 2× Taq PCRMasterMix，1μL模板DNA。PCR擴增程序為：95℃預變性5min；94℃變性30 s。55～57℃（按特定引物設定）退火1min，72℃延伸1min，共35個循環；72℃延伸10min后4℃保存取擴增產物5 uL加Loading Buffer進行上樣，在2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓110 V，35min，電泳完后在凝膠成像系統下觀察、拍照并記錄。

1.5 數據處理與分析

根據微衛星引物擴增結果，運用Quantity One軟件進行分析處理，建立SSR的0-1數據庫，將電泳譜帶的有無轉換成二進制，有亮帶即為1，無亮帶即為0。用DPS數據處理系統的Nei&Li方法進行計算遺傳距離，運用最長距離進行宗譜歸類。

2 結果與分析

2.1 供試菌株的PCR擴增

14對SSR引物對89個供試菌株進行了有效擴增，不同引物擴增不同的供試菌株呈現均有不同。KMS02、KMS20、C3、A5、G5、D4、D5、SMS17、FG01、FG02、FG03、MS355、MS363、MS677分別擴增出112、128、130、143、147、134、212、154、82、133、79、128、88和72條亮帶，充分體現出89個稻瘟病菌株的多態性，復雜性。代表性擴增結果如圖1所示。

2.2 桃江病圃稻瘟病菌群體的遺傳組成

圖1 引物MS363對部分供試菌株的擴增（M為D N A分子量標準；76～103為供試菌株）

89個供試稻瘟病菌株在0.72的相似系數下被劃分為20個遺傳宗譜，其中優勢宗譜是L06和L07，分別含有18和13個菌株，各占總菌株數的20.2%和14.6%，有6個宗譜分別含4～7個菌株，共占總菌株數的34.8%。另12個宗譜分別含菌株1～3個，共占總菌株數的30.3%；具體聚類分析結果見表2。

表2 0.72相似系數下89個供試菌株的遺傳宗譜

3 小結與討論

稻瘟病是危害水稻最嚴重的真菌病害之一，在水稻新品種推廣3～5 a后會因田間稻瘟病菌種群的小種變異而喪失抗性成為感病品種，因此及時準確地了解田間稻瘟病菌群體的變化趨勢尤為重要[8-10]。

本研究表明2013年湖南桃江稻瘟病圃中的稻瘟病群體結果相對復雜，遺傳多樣性明顯。虞選杰等[11]應用13對引物對2012年湖南桃江采集分離的100個稻瘟病菌菌株進行PCR擴增，并依據擴增反應結果，對供試稻瘟病菌群體進行聚類分析，將100個稻瘟病菌菌體劃分為24個遺傳宗譜。而本研究于2013年在湖南桃江采集分離得到的89個稻瘟病菌菌體被分為20個遺傳宗譜，其遺傳宗譜未發生較大的變化，這說明該病圃稻瘟病菌群體在一定的時期內相對較穩定。因此，該病圃作為國家和湖南水稻品種抗稻瘟病鑒定點是合適的。

SSR分子標記技術，不僅具有共性好，重復性好，多態性高，擴增結果穩定，而且能準確建立SSR的0-1數據庫，并計算出遺傳宗譜。本試驗結合歷年對湖南稻瘟病遺傳結構的研究，初步揭示了LTH上的稻瘟病菌與湖南各稻區栽種品種上的稻瘟病菌在遺傳結構上的相似性，且遺傳宗譜更豐富，遺傳多樣性更復雜，可為全面了解湖南地區稻瘟病變化趨勢，以及抗病育種和利用遺傳多樣性控制稻瘟病的危害與流行提供理論依據。

[1]鄧其明，周 鵬，林 琳，等.水稻稻瘟病抗性基因研究進展及其在育種上的應用[J].安徽農業科學，2009，37（4）：1489-1492，1508．

[2] 李 亞，劉二明，戴良英，等.湖南稻瘟病菌群體遺傳多樣性與病菌致病型的關系[J].中國水稻科學，2007，21（3）：304-308.

[3] 王 靜，李彥泉.水稻稻瘟病綜合防治技術[J].吉林農業，2012，（6）：69．

[4] 穆慧敏，姜 華，王艷麗，等.研究稻瘟病菌群體遺傳多態性的分子標記方法[J].中國水稻科學，2013，27（5）：545-552.

[5] 譚清群，楊學輝，何海永，等.32份水稻抗稻瘟病材料的SS R遺傳多樣性分析[J].西南農業學報，2012，25（2）：479-484.

[6] 涂 敏，王云月，盧寶榮，等.云南省水稻品種稻瘟病抗性差異與遺傳多樣性相關研究[J].湖北農業學報，2011，50（6）：1149-1152.

[8]李小湘，肖軍治，段永紅，等.湖南同名地方稻資源SS R標記及表現型的比較分析[J].植物遺傳資源學報，2014.，15（2）：248-254.

[9]劉二明，劉志賢，魏 林，等.湖南兩類稻瘟病生態系病菌群體遺傳多樣性研究[J].湖南農業大學學報（自然科學版），2003，29（3）：211-215．

[10]黃國慶，郭加沅，肖國櫻.SS R標記在水稻遺傳育種中的應用[J].江西農業學報，2007，19（4）：20-22.

[11]虞選杰，任佐華，管玲莉，等.湖南桃江病圃麗江新團黑谷上稻瘟病菌遺傳多樣性分析[J].雜交水稻，2014，29（3）：70-73.

（責任編輯：盧紅玲）

Analysis of Genetic Diversity of Magnaporthe oryzae in Rice Blast Nursery in Taojiang of Hunan by SSR Markers

MAORui1,2，REN Zuo-hua1,2，LIU Xiang1,2，NILan-feng1,2，ZHOU Hu1,2，DAILiang-ying1,2，LIU Er-Ming1,2
（1.College of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC;2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests,Changsha 410128,PRC）

To explore the genetic diversity of Magnaporthe oryzae in rice blastnursery in Taojiang,Hunan,89 single spore isolates of Magnaporthe oryzae isolated froMhighly broad spectruMsusceptible blast variety,Lijiangxintuan were analysed by the SSR technology w ith the14 pairsof primers.The results showed that these isolateswere classified into 20 genetic lineages at the0.72 siMilar level,among which L06 and L07,including 18 and 13 isolates,respectively,accounting for 20.2%and 14.6%of the total isolates,were the dominant lineages,while there were 4～7 isolates accounting for 34.8%of the total isolates in the another 6 lineages,and hold 1～3 isolates accounting for 30.3%of the total isolates in the other 12 lineages.Therefore,it suggested that the blast nursery possessed constituent complex of M.oryzae population and rich genetic diversity.Atpresent,breeding of resistantto riceblast for Hunanmay beagainst L06 and L07 lineages.

blastnursery;Magnaporthe oryzae;SSR;genetic diversity

S435.11.41

A

1006-060X（2015）04-0035-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.013

2015-03-20

公益性行業（農業） （201203014）；湖南省自然科學基金青年項目（12JJ4028）

毛 銳（1990-），男，湖南長沙市人，碩士研究生，研究方向為微生物與植物分子互作。

劉二明