沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

周忠坤

山東省煙臺市福山區動物衛生監督所

一、引言

豬霍亂沙門氏菌屬是寄生于人和動物腸道內的無芽胞直桿菌，革蘭氏陰性，生化特性和抗原結構相似，兼性厭氧。本屬菌現可分為：腸道沙門氏菌和邦戈爾沙門氏菌兩個種。 豬霍亂沙門氏菌呈直桿狀，0.7～1.5um×2.0～5.0um,革蘭氏陰性[1]。在麥康凱瓊脂培養基上通常形成無色菌落， 在SS 瓊脂培養基上常形成無色但中心稍發黑的菌落，因該菌絕大多數可分解產生H2S，可使三糖鐵瓊脂培養基變黑。在培養基中加入硫代硫酸鈉、胱氨酸、血清、葡萄糖、腦心浸液和甘油等均有助于本菌生長。 本屬菌均有致病性，具有極其廣泛的動物宿主。本菌最常侵害幼、青年動物，使之發生敗血癥、胃腸炎及其他組織局部炎癥。 沙門氏菌很容易在動物與動物、動物與人、人與人之間通過直接或間接地途徑傳播，沒有中間宿主。 主要傳染途徑是消化道,豬霍亂沙門氏菌生命力頑強,對外界的抵抗力較強,在凍土中可過冬。對消毒劑的抵抗力不強,3%來蘇兒、福爾馬林等能將其殺死。 關于沙門菌耐藥性機制,主要集中于以下幾個方面： 拓撲異構酶基因的突變；抗菌藥物攝取或累積量降低；可轉移遺傳元件介導的耐藥性機制；質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥性[2]。

本實驗對本地區某豬場患病豬進行了病原菌分離鑒定及藥敏試驗,為查明病因和進一步選用有效的抗生素進行臨床治療提供科學根據。

二、材料與方法

1.材料

實驗動物某豬場患豬。

培養基。 麥糠凱瓊脂培養基、SS 瓊脂培養基、MH瓊脂培養基，均購自廣州環凱；營養肉湯培養基、三糖鐵瓊脂培養基，按照標準方法自行配制。

藥敏紙片。藥敏試驗用16 種藥敏紙片，購自由杭州天和。

革蘭氏染色液自行配制。

2.試驗方法

（1）病料采集及細菌分離。 對某豬場患豬進行病料采集。 將病料用含5%小牛血清的營養肉湯活化，37℃培養24 小時增菌[3]。將渾濁的肉湯培養物用接種環劃線接種于麥康凱瓊脂培養基和SS 瓊脂培養基上，37℃培養24 小時。將麥康凱培養基上的無色菌落和在SS 瓊脂培養基上無色， 菌落中心位置發黑的可疑菌落接種于普通肉湯培養基中培養， 用60%甘油保存，并進一步做生化鑒定實驗。

（2）細菌鑒定。革蘭氏涂片染色法：用接種環挑取單個菌落涂于玻璃片上，采用革蘭氏染色，并進行顯微鏡觀察。

三糖鐵試驗。把營養肉湯中培養的純菌培養液接種于三糖鐵瓊脂培養基上，觀察是否產氣及顏色的變化。

生化試驗。 用接種針跳取細菌純菌落，分別接種于腸桿菌科細菌生化鑒定管中， 溫箱中培養24 小時觀察。

（3）藥敏試驗。 紙片擴散方法（K-B）藥敏試驗,將配制好的菌液1 毫升用涂菌棒均勻涂于MH 平板上，待菌液完全晾干后用滅菌小鑷子將藥敏紙片輕輕貼于澆好的MH 瓊脂上，每個平板貼4 張紙片，每張紙片間距不少于24 毫米， 紙片中心距平皿邊緣不少于15 毫米。 溫箱中倒置培養24 小時后觀察結果。24 小時后將貼有藥敏紙片的平皿取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑， 從平板背面測量最接近的整毫米數并記錄，抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限[4]。結果依據CLSI 推薦的標準進行分離菌株的耐藥性判定。

三、結果

1.培養特性及形態特征

采集的病料經營養肉湯增菌后變渾濁。37℃培養24 小時，在麥糠凱瓊脂平板上呈無色菌落，濕潤，隆起。SS 瓊脂平板上呈無色中心發黑的菌落，見圖1。分離菌株革蘭染色呈陰性，兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，無莢膜，都有周身鞭毛，見圖2。

圖2 革蘭氏染色細菌形態

2.三塘鐵試驗

分離菌株肉湯培養物穿刺斜面后，斜面頂部呈黑色，表明H2S 產生，底部產酸，呈黃色，且上部呈紅色。由于沙門氏菌只能利用葡萄糖，葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃，因接觸空氣而氧化，細菌利用培養基中含氮物質，生成堿性產物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。

3.生化試驗

將分離菌株的肉湯純培養物接種于腸桿菌科細菌生化鑒定管中培養37℃24 小時， 編碼42361 對應菌名為豬霍亂沙門氏菌，鑒定值為95.31%。因此根據生化鑒定結果初步判定該菌為豬霍亂沙門氏菌。結果見表1。

表1 菌株生化鑒定結果

4.藥敏試驗

分離菌株對鏈霉素，慶大霉素，多粘菌素B，諾氟沙星，恩諾沙星，氧氟沙星敏感，對卡那霉素，氯霉素，紅霉素，頭孢噻肟中介，對氨芐西林，四環素，頭孢拉定，頭孢唑林，呋喃唑酮呈現出不同程度的耐藥性。結果見表2。

表2 抗菌藥物紙片藥敏試驗結果

四、討論

本次試驗從患豬體內分離到一株豬霍亂沙門氏菌，并通過藥物敏感性試驗對該菌的耐藥性進行了初步研究。 試驗結果表明，對氨芐西林，四環素，頭孢拉定，頭孢唑林，呋喃唑酮呈現出不同程度的耐藥性。總體來說該菌對硝基呋喃類， 四環素類和β-內酰胺類的抗微生物藥產生耐藥性，如青霉素，頭孢菌素等，是獸醫臨床實踐中最常用的抗菌消炎藥。 但是，濫用該類抗微生物藥， 已經造成敏感菌產生了強大的耐藥性，為感染性疾病的治療帶來了巨大的困難[5]。對該區域定期進行監測， 為今后的臨床用藥提供合理的參考，防止由于盲目用藥而造成耐藥敏感菌產生，減少由此帶來的經濟損失。 同時應加強飼養管理, 增強抗病能力；對于患病豬進行無害化處理，做好消毒工作,保持良好的衛生條件。

[1]陸承平. 獸醫微生物學[M].中國農業出版社，2001.

[2]肖春玲,姚天爵.細菌耐藥性與新抗菌藥物的研究[J].中國醫學科學院學報,2004, 26(4)：351-353.

[3]劉華偉，馬立農等.畜禽及環境中沙門氏菌的PCR快速檢測與控制[J].家畜生態學報.2005,2：59-63.

[4]佟金平，王鎮山等.磷霉素與14 種抗菌藥物分別連用的體外抗菌活性研究[J]. 中國抗生素雜志，2005,4(30)：229-232.

[5]糜租煌.細菌耐藥的分子機制[J].臨床兒科雜志,2005,23(7)：422-424.