藏藥五脈綠絨蒿不同部位紅外光譜的識別

趙慶帥 ，周玉碧，孫勝男，盧學峰，葉潤蓉，彭 敏，孫 菁*

1中國科學院西北高原生物研究所，青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室，西寧 810008;2中國科學院大學，北京 100049

五脈綠絨蒿(Meconopsis quintuplinervia Regel.)是罌粟科(Papaveraceae)綠絨蒿屬(Meconopsis Vig.)多年生草本植物，青藏高原特有種［1］，是藏族傳統用藥“歐貝完保”的原植物之一。主要集中分布于青藏高原地區，多生長于海拔3200～3800 m 的高山草甸和陰坡灌叢，所含活性成分以生物堿類、黃酮類化合物等為主［2］。全草鎮靜熄風，定喘，清熱解毒，具有重要的藥用價值［3］。

中藥紅外光譜宏觀指紋分析法是中藥學與分析化學相結合的產物，是一種基于中藥紅外光譜宏觀指紋特征的綜合分析方法［4］，對以多組分整體用藥的中醫和藏醫理論來說，單個或多個目標成分的檢測和控制不能全面的反映原藥材的質量，紅外光譜的變化反映藥材這一混合物體系化學成分上的變化和差別，可以作為評價藥材質量的一項關鍵指標，因此具有快速、高效、宏觀整體特征性強等特點的紅外光譜在質量控制方面逐漸顯示出其優勢［5，6］。本文采用傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)法對五脈綠絨蒿不同部位進行了分析鑒別，為五脈綠絨蒿藥材資源的綜合開發利用提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五脈綠絨蒿樣品于2014 年7 月(花果期)采自青海省祁連縣冰溝大阪。采集30 株樣品，帶回實驗室后，將五脈綠絨蒿陰干，其中20 株按花、葉、花梗分開，剩下10 株做全草，各部位研磨后過200 目篩，待分析用。原植物標本由中國科學院西北高原生物研究所盧學峰副研究員鑒定為五脈綠絨蒿(Meconopsis quintuplinervia Regel.)。

紅外光譜儀為Thermo Nicolet 公司IS50 傅立葉變換紅外光譜分析儀，DTGS 檢測器，十萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，瑪瑙研缽。

1.2 實驗方法

1.2.1 譜圖采集方法

采用KBr 壓片法，樣品與KBr 比例為1∶50，混合均勻后在瑪瑙研缽中研磨，放入壓片機壓成透明或半透明的薄片，然后將樣品片放入樣品架內進行測試。采用DTGS 檢測器，掃描范圍4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32 次，每份樣品掃描5 次，掃描時即時去除水和CO2的干擾，取其平均譜圖，將不同部位的平均譜圖作為各部位的紅外光譜標準譜圖。

1.2.2 數據處理

OMNIC 7.0 軟件完成樣本紅外光譜數據采集以及光譜數據預處理，方法是首先對采集到的光譜數據進行基線校正，消除采集過程中的基線漂移，然后對數據進行縱坐標歸一化。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 分辨率選擇試驗

將制好的同一樣品壓片，分別在分辨率為1、2、4、8、16 cm-1的條件下平行測定，結果如圖1 中譜線1 至譜線5 所示。結果表明，分辨率為4、8、16 cm-1的條件下均能滿足樣品分析要求，同時分辨率低可能使某些重疊譜帶分不開［7］，最終實驗選定分辨率為4 cm-1進行測定。

圖1 不同分辨率下五脈綠絨蒿紅外光譜圖(n=5)Fig.1 IR spectra of M.quintuplinervia with different resolutions (n=5)

2.1.2 掃描次數

將制好的同一樣品壓片，在分辨率為4 cm-1的條件下，分別掃描4 次、8 次、16 次、32 次、64 次，平行測定，結果如圖2 中譜線1 至譜線5 所示。結果表明，掃描次數為8 次、16 次、32 次、64 次均滿足樣品測定條件，基于掃描次數越多，光譜信噪比越高［7］以及節省時間的目的，最終實驗選擇掃描32 次進行檢測。

圖2 不同掃描次數下五脈綠絨蒿紅外光譜圖(n=5)Fig.2 IR spectra of M.quintuplinervia with different scanning times (n=5)

2.1.3 精密度試驗

取五脈綠絨蒿樣品1 份，按“1.2”項下方法連續測定5 次，得到的紅外光圖譜基本一致。用OMNIC7.0 軟件計算相似度，測得的紅外圖譜與其所得平均譜圖的相似度分別為0.9995、1.000、1.000、1.000、0.9996，RSD 值為0.017%。結果表明儀器精密度良好，滿足樣品分析要求。

2.1.4 重復性試驗

同一份樣品，按“1.2”項下方法重復壓片5 次，分別進行掃描測定。用OMNIC7.0 軟件計算相似度，測得的紅外圖譜與其平均譜圖的相似度分別為0.9837、0.9849、0.9942、0.9900、0.9846，RSD 值為0.455%。表明該實驗方法具有良好的重復性。

2.1.5 穩定性試驗

取同一份五脈綠絨蒿樣品片放入干燥器內保存，每隔1 d 測定1 次，結果顯示5 d 內所得紅外圖譜具有較好的一致性，測得的紅外圖譜與其平均譜圖的相似度分別為:0.9993、0.9817、0.9989、0.9973、0.9988，RSD 值為0.762%。結果表明樣品穩定性良好，滿足樣品分析要求。

2.2 五脈綠絨蒿不同部位的一維紅外光譜分析

根據文獻對主要紅外吸收譜帶進行指認和歸屬，結果如表1 所示。在3372 cm-1附近為O-H 鍵伸縮振動譜帶;2923 cm-1附近為亞甲基的C-H 鍵反對稱伸縮振動譜帶;1742 cm-1附近為酯類羰基C=O鍵的伸縮振動譜帶［8］;1653 cm-1附近為O-H 鍵彎曲振動、黃酮類或蛋白質類共軛羰基的伸縮振動或蛋白質酰胺Ⅰ帶吸收譜帶［9］;1516 cm-1為苯環骨架伸縮振動吸收譜帶［10］;1470～1400 cm-1附近可能含有黃酮及生物堿類等多種成分的芳香環的骨架振動、C-H 彎曲振動吸收譜帶［11］;1373 cm-1是酯類C-H 彎曲振動吸收譜帶［5］;1245 cm-1為糖類C-O 伸縮振動譜帶［5，10］;1162、1106、1058 cm-1附近為糖苷類C-O鍵的伸縮振動譜帶［12］。在1162～1058 cm-1附近花梗的吸收強度明顯強于其他部位，推測花梗中所含糖類成分較多，這可能是由于花梗中還有較高的纖維素所致。

表1 五脈綠絨蒿主要紅外吸收譜帶歸屬Table 1 The assignments of main IR absorption peaks of M.quintuplinervia

以五脈綠絨蒿全草的紅外譜圖為參照，利用OMNIC 7.0 軟件的質量檢查功能計算花梗、葉、花與全草的相似系數分別為0.8942、0.9757、0.9549，結果顯示以全草和葉的相似系數最高，花次之，與花梗差別最大，但整體上一維紅外光譜不同部位之間相似性較高。

圖3 五脈綠絨蒿不同部位的一維紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of different parts of M.quintuplinervia

圖3 給出了五脈綠絨蒿不同部位一維紅外光譜圖。因3372 cm-1和1653 cm-1譜帶受KBr 壓片時引入的空氣水分及樣品的干燥程度的影響，除這兩個譜帶外，1058 cm-1吸收譜帶強度在一維紅外圖譜所有吸收譜帶中譜帶強度最高，因此以1058 cm-1處譜帶強度為基準，分別對2923、1738、1420 cm-1等主要特征譜帶的吸收譜帶強度進行初值化處理，所得結果作為該部位紅外光譜主要特征譜帶的相對強度(見表2)，并對此相對強度進行分析比較。差0.71 倍，表明花部分苯環骨架振動較強，花梗部分振動較弱。可見不同部位一維紅外光譜圖在相同譜帶呈現出明顯差異，利用一維紅外光譜能比較快速地對五脈綠絨蒿不同部位進行識別。

表2 不同部位主要特征譜帶的相對強度Table 2 Relative intensity of the characteristic peaks of different parts of M.quintuplinervia

2.3 五脈綠絨蒿不同部位的二階導數紅外光譜分析

二階導數紅外光譜可以增強光譜的表觀分辨率，分辨原譜中重疊的吸收譜帶或使一些特征譜帶間的差異更明顯，進而找出特定化合物的特征吸收譜帶并提高圖譜的指紋特征性［13，14］。因此，對五脈綠絨蒿全草、花梗、葉和花在1800～800 cm-1范圍內紅外譜圖進行了二階導數處理(圖4)，花梗、葉、花與全草的相似系數分別為0.7853、0.9296、0.7853，表明不同部位間紅外譜圖大致相似，但不同部位間二階導數差異明顯比一維譜圖顯著。

一維紅外圖譜中差異不顯著的各波段，經二階導數處理后許多被掩蓋的吸收譜帶強度差異顯現出來。從圖4 可知，不同部位五脈綠絨蒿藥材在1517～1471 cm-1波段和1162～1107cm-1波段呈現出多樣的譜帶形狀和不同的吸收強度，明顯表現出較大的差異。其中在1517～1471 cm-1波段，花中1517 cm-1譜帶強度高于1471 cm-1，全草中1517 cm-1附近吸收譜帶強度與1471 cm-1的譜帶強度基本一致，花梗和葉中1517 cm-1譜帶強度低于1471 cm-1;而在1162～1107 cm-1波段，花梗和葉中1162 cm-1譜帶強度高于1107 cm-1，全草中1162 cm-1附近吸收譜帶強度與1107 cm-1的譜帶強度基本一致，而花中1165 cm-1譜帶強度低于1107 cm-1。因此，可將1517～1471 cm-1和1162～1107 cm-1這兩個波段作為五脈綠絨蒿不同部位二階導數之間差異特征。

綜上，與一維紅外譜圖相比，在1800～800 cm-1范圍內五脈綠絨蒿不同部位間的二階導數譜圖譜差異顯著。二階導數譜圖的1517～1471cm-1和1162～1107cm-1波段可作為區分不同部位的重要特征。

圖4 五脈綠絨蒿不同部位的二階導數紅外光譜圖Fig.4 Second derivative infrared spectra of different parts of M.quintuplinervia

3 結論

采用傅立葉紅外光譜法對五脈綠絨蒿的全草、花梗、葉和花的一維紅外光譜和二階導數譜進行了識別分析。在一維紅外光譜譜4000～400 cm-1范圍內，對主要吸收譜帶進行了基團的歸屬分析，其中1162、1106、1058 cm-1附近為糖苷類C-O 鍵的伸縮振動譜帶，花梗的吸收強度明顯強于其他部位，推測花梗中所含糖類成分較多，這可能是由于花梗中還有較高的纖維素所致;不同部位間紅外譜圖相似性高，同時主要特征譜帶的相對強度的比值可以作為五脈綠絨蒿一維紅外光譜差異特征。二階導數紅外光譜譜圖花梗、葉、花與全草的相似系數分別為0.7853、0.9296、0.7853，較之一維紅外譜圖差異顯著，同時1517～1471 cm-1和1162～1107 cm-1波段是區分不同部位的重要特征。

結果表明，五脈綠絨蒿一維紅外光譜和二階導數譜圖能將不同部位的五脈綠絨蒿識別。因此，通過分析比較五脈綠絨蒿不同部位的紅外譜圖，可以宏觀整體地把握五脈綠絨蒿不同部位的成分差異，為現代監控手段分析傳統藏藥的思路提供依據。

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