HPLC 法同時測定不同栽培年限亳芍中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量

陳乃東 ，陳 翰，陳乃富，2，李 清，陳 瓊，謝小樂

1皖西學院生物與制藥工程學院;2皖西中藥與天然藥物工程技術研究中心，六安 237012;3 安徽醫科大學，合肥 230032

亳芍(Bozhou Peony Paeonia lactiflora)，即亳白芍，是芍藥科植物芍藥或其變種毛果芍藥栽培品的根［1］，為安徽道地藥材之一，主產安徽省亳州地區。味苦、酸、甘，性微寒，具養血斂陰柔肝止痛、平抑肝陽等功效［2］，以芍藥總苷為主要活性成分，其中芍藥苷和芍藥內酯苷約占總苷70%以上［3］。現代藥理研究表明，芍藥苷具有增加冠脈流量，擴張冠狀動脈，對抗急性心肌缺血，抑制血小板凝聚及降低血壓等作用［4］，芍藥內酯苷具有鎮痛、鎮靜、抗驚厥作用［5-7］。芍藥苷和芍藥內酯苷的含量對亳芍臨床用藥具有重要影響。

中藥的活性成分積累與栽培年限密切相關。截止目前，有關白芍中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量研究主要集中在不同提取方法和不同產地的含量比較［8-10］，尚未見栽培時間對亳芍主要活性成分芍藥苷、芍藥內酯苷積累的影響的報道。

本文建立了一種同時測定芍藥苷和芍藥內酯苷的檢測方法，在此基礎上，對不同生長年限亳芍中的芍藥苷及芍藥內酯苷進行含量變化研究，為探討中藥亳芍的最佳藥材采收時期、規范化種植、質量評價及臨床用藥提供依據。

1 儀器與材料

分析天平(FA1004 型，中國上海精科有限公司)，超聲清洗器，Lanbo Service 4000 高效液相色譜儀(EZchrom Elite 軟件，UV4000 二極管陣列檢測器，美國Lanbo 公司)，循環水式多用真空泵(SHB-3S 型，鄭州長城科工貿有限公司)。標準對照品芍藥苷(含量測定用，含量≥98%，批號:B10091)、芍藥內酯苷(含量測定用，含量≥98%，批號:B10102)均購自上海士鋒生物科技有限公司。乙腈(色譜純，上海星可高純溶劑有限公司)，水為市售娃哈哈純凈水，其余試劑均為國產分析純。

實驗材料亳芍2013 年8 月于亳芍道地產區安徽省亳州市6 個不同的亳芍種植基地，品種經皖西中藥與天然藥物工程技術研究中心陳乃東博士鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.干燥的根。6 個不同栽培基地分別挖取栽培1～7 年的亳芍，共42 個樣品，洗凈，去皮，晾干，備用。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制

以50% 乙醇配制成濃度125.0 μg/mL、22.5 μg/mL 芍藥苷和芍藥內酯苷對照品溶液適量，0.45 μm 微孔濾膜過濾、備用。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取亳芍粉末0.5 g，置50 mL 容量瓶中，加50%的乙醇35 mL，60 ℃超聲處理(240 W，45 kHz)30 min，冷卻，加50%的乙醇定容至刻度，過濾，精密量取續濾液2 mL 以50%的乙醇定容到8 mL，微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

2.3 色譜條件

Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序如下:0～5 min，5%～10%A;10～15.0 min，10～15%A;15.0～17.0 min，15～30%A;17～30.0 min，30%A;30.0～35.0 min，30～100%A;35～40.0 min，100%A。流速:1.0 mL/min;檢測波長:230 nm;柱溫為30 ℃。

在上述色譜條件下，對照品和供試品溶液HPLC 檢測結果如圖1 所示。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察

分別緊密吸取2.1 項下配制的芍藥苷、芍藥內酯苷對照品溶液各1、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，按2.3 項下色譜條件，測定芍藥苷、芍藥內酯苷峰面積，平行測定三次，取平均峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(Y)，對照品質量進樣量(μg)為橫坐標(X)，分別得到的芍藥苷和芍藥內酯苷回歸方程:y=1.2 ×1010x-3.5 ×106，R2=0.9960;y=1.1 ×106x-3.9×105，R2=0.9994。結果表明，芍藥苷和芍藥內酯苷在0.1250～2.5000 μg 和0.0225～0.4500 μg 范圍內，分別與對應峰面積呈良好的線性關系。

圖1 芍藥苷和芍藥內酯苷混合對照品溶液(A)、樣品溶液(B)及樣品溶液與對照品混合溶液(C)的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A)，Bozhou Penoy (B)and mixed solution of standards and Bozhou Penoy sample (C)

2.4.2 穩定性試驗

稱取亳芍樣品適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10.0 μL，分別于0、4、8、12、16、20、24、48 h 進樣。結果表明芍藥內酯苷、芍藥苷峰面積的RSD 分別為0.96%和0.85%，說明樣品溶液在48 h 內穩定較好。

2.4.3 重復性試驗

稱取同一批次亳芍樣品粉末6 份，按2.2 項方法制備供試品溶液，精密吸取10.0 μL，按2.3 色譜條件測定。結果顯示芍藥內酯苷和芍藥苷峰面積的RSD 分別為1.83%、1.79%，表明本測定方法重復性良好。

2.4.4 精密度試驗

精密吸取2.1 項項下配制的芍藥苷和芍藥苷內酯對照品溶液各10.0 μL，按2.3 項述方法，連續進樣6 次，測得二者峰面積RSD 均小于1.5%，說明儀器精密度良好。

2.4.5 回收率試驗

精密稱取0.5 g 已知含量的亳芍樣品粉末9份，每3 份一組，依次精密加入高、中、低3 個水平芍藥苷對照品5.0、1.0、0.1 mg 和藥內酯苷2.0、0.5、0.1 mg，按2.2 項方法制備供試品溶液，按2.3 項方法進行測定，計算回收率。結果芍藥內酯苷的平均回收率為101.30%，RSD 為2.57%;芍藥苷的平均回收率為100.56%，RSD 為2.10%。

2.5 樣品含量測定

精密稱取栽培1～7 年的亳芍樣品粉末各0.5 g，按2.2 項方法制備成供試品溶液，精密吸取10.0 μL 按2.3 項方法進行測定，測得不同栽培年限的亳芍中芍藥苷和芍藥內酯苷HPLC 色譜圖(圖2)，記錄芍藥苷和芍藥內酯苷的峰面積，利用建立的芍藥苷和芍藥內酯苷標準曲線，計算樣品中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量(圖3)。

圖2 不同株齡的亳芍芍藥苷、芍藥內酯苷HPLC 檢測結果Fig.2 HPLC analysis of paeoniflorin and albiflorin in different years-old of Bozhou Peony P.Lactiflora

1～7 年株齡亳芍的芍藥苷含量依次為:3.26 ±0.20%、4.97 ± 0.18%、5.84 ± 0.20%、3.57 ±0.06%、3.38 ± 0.12 %、3.37 ± 0.07%、2.70 ±0.03%。1～7 年株齡亳芍的芍藥內酯苷含量分別為:0.66 ±0.09%、1.71 ±0.09%、0.48 ±0.07%、0.83 ±0.02%、0.48 ±0.02%、0.47 ±0.03%、0.27±0.04%。上述檢測結果表明，亳芍中芍藥內酯苷的含量遠少于芍藥苷，芍藥苷和芍藥內酯苷的含量因株齡的不同存在一定差異。1～7 年株齡亳芍，以3 年株齡的芍藥苷含量最多，2 年株齡的芍藥內酯苷含量最多。

圖3 不同株齡的亳芍芍藥苷和芍藥內酯苷含量Fig.3 The contents of paeoniflorin and albiflorin from different years-old of Bozhou Peony P.Lactiflora

株齡1～7 年的亳芍中芍藥苷和芍藥內酯苷含量的方差分析顯示，芍藥苷在1～3 年含量呈遞增趨勢，3 年后含量降低，4～7 年株齡的芍藥苷含量差別無統計學意義(表1)，說明栽培3 年后，亳芍中芍藥苷含量趨于穩定;芍藥內酯苷在1～2 年呈遞增趨勢，2 年后含量降低，5～7 年含量平穩無統計學意義(表2)，說明隨著栽培年限增加，芍藥內酯苷含量趨于穩定。上述結果分析表明，如以芍藥苷含量為評價標準，以栽培3 年的亳芍藥材品質較好。如以芍藥內酯苷為依據，亳芍栽培2 年做藥效果較好。

表1 不同生長年限的亳芍芍藥苷含量方差分析結果Table 1 The ANOVA results of paeoniflorin contents in Bozhou Peony P.lactiflora with different growth years

表2 不同生長年限的亳芍芍藥內酯苷含量方差分析結果Table 2 The ANOVA results of albiflorin contents in Bozhou Peony P.lactiflora with different growth years

3 結論

首次對不同生長年限的安徽道地藥材——亳芍中芍藥苷和芍藥內酯苷含量進行對比研究，研究發現三年株齡亳芍中芍藥苷含量最高，兩年株齡芍藥內酯苷含量最多。研究結果對亳芍采收時期的確定、質量標準研究和亳芍的藥物作用機制及臨床應用提供新的參考依據。

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