速熟腐乳生產中腐乳成分及微觀結構的分析

汪建明，張 燕，于水淼，賀 樂，李立英

(食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

腐乳作為大豆的一種發酵制品，富含蛋白質以及亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸，不含膽固醇等[1].發酵成熟的腐乳具有營養較豐富、質構較細膩柔滑、滋味鮮美和誘人食欲的特點，是人們喜愛的開胃佐餐食品和調味品.在歐美，腐乳因其質構類似軟質干酪而被稱為“Chinese-cheese”[2].

傳統腐乳的后酵過程是形成其特殊質地和風味的關鍵，但是后期成熟周期較長，一般情況下要經過4～6 個月，腐乳的色、香、味才能達到品質要求，使得工廠的生產效率偏低，經濟成本偏高.因此，在添加一定酶制劑促進蛋白質和脂肪酶解的基礎上，采用添加乳酸菌混合菌種發酵劑發酵、產酸實現凝乳，從而得到的速熟腐乳，既可以改善傳統腐乳產品發酵周期長的問題，同時可提高生產效率.

腐乳的質量評價通常是通過感官評定來確定，但是感官評定的重現性不佳，所以不能作為唯一的評價指標.氨基態氮含量和蛋白質水解度可以作為評價腐乳成熟程度的指標之一，二者呈正相關性.聚丙烯酰胺-凝膠電泳(SDS-PAGE)是分離腐乳蛋白成分并確定其相對分子質量的有效方法，這種方法基于蛋白質或肽的物理性質進行分離[3-5].腐乳質構主要指腐乳內在的性質，如彈性、黏性、硬度、脆性.此外，水分含量也影響腐乳的質地.利用掃描電鏡可以對腐乳進行微觀結構觀察.

本文研究了利用乳酸菌混合發酵劑生產速熟腐乳在成熟過程中的理化指標、感官品質、蛋白質水解度、質構特性以及微觀結構變化，并與市售腐乳進行對比.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

大豆，市售；MT-53X(乳酸菌、乳脂乳球菌、嗜熱鏈球菌)發酵劑、Accelerzyme CPG、Piccantase A，荷蘭DSM 公司；利民市售腐乳，天津市利民調料有限公司；王致和市售腐乳，北京王致和食品集團有限公司.

1.1.2 主要試劑

甲醛，中國醫藥上海化學試劑公司；硝酸銀，上海化學試劑廠；鉻酸鉀，北京化學試劑公司；丙烯酰胺，北京鼎國昌盛生物技術有限公司；N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷，北京化工廠；過硫酸銨，天津市北方天醫化學試劑廠；β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R-250，Amresco 化學試劑公司；甘氨酸，天津市化學試劑一廠；十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)，加拿大BBI 公司.

1.1.3 主要設備

FE-20 型pH 計、AB204-N 型電子分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；SU1510 型掃描電鏡，日本電子株式會社(JEOL)；JY-SP-BT 型電泳槽、JY-600 型電泳儀，北京六一電泳設備有限公司；高速臺式冷凍離心機、冷凍干燥機，Thermo 電子公司；臺式恒溫振蕩培養箱，北京沃德創意技貿有限責任公司；HWS260 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；TA-XT 質構儀，英國Stable Micro Systems公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

速熟腐乳的制作流程如圖1 所示.

圖1 速熟腐乳的制作流程圖Fig.1 Flow chart of making instant-sufu

1.2.2 樣品的制備[6-7]

豆漿：大豆500,g，液料比(mL∶g)為1∶3，24.5,℃浸泡9,h，磨漿水溫61,℃.

白坯：豆漿(固形物含量8%)，酶制劑(m(CPG)∶m(A)＝2∶1)添加量為1.5,mg/L，發酵劑的添加量為0.2,mL/L，培養溫度為30,℃，培養時間為6,h，氯化鈣的添加量為0.2,g/L，將白坯切成3.0,cm×3.0,cm×3.0,cm 的豆腐塊備用.

毛坯：在制成的白坯豆腐塊上噴灑毛霉孢子，在28,℃電熱恒溫培養箱中培養40,h.

腐乳：將經酶解的毛坯在75～80,℃條件下保持30,min，再將經滅酶的毛坯放在湯料中，進行后酵貯藏.

1.2.3 腐乳的感官評定

按照DB,52/525—2007[8]，評分標準與細則見表1.

表1 腐乳的感官評分標準Tab.1 Sensory evaluation rules of sufu

1.2.4 測量方法

水分含量的測定采用直接干燥法[9].

總酸含量(乳酸)的測定采用酸堿中和滴定(酸度計)法[10].

氨基酸態氮含量的測定采用甲醛滴定法[11-12].

蛋白質含量的測定采用凱氏微量定氮法[13].

NaCl 含量的測定采用硝酸銀滴定法[14]，并稍作改進：精確稱取10,g 樣品，加入90,mL 蒸餾水攪拌均勻，在電爐上燒開后冷卻，定容至100,mL.精確吸取5,mL，隨后加入25,mL 蒸餾水，加入10 滴鉻酸鉀指示劑，用0.1,mol/L 硝酸銀滴至磚紅色為終點，記錄消耗硝酸銀標準溶液的體積.同時進行試劑空白實驗，計錄空白滴定消耗硝酸銀標準溶液的體積.NaCl含量的計算公式為

式中：V 為消耗硝酸銀標準溶液的體積，mL；V0為空白滴定時，消耗硝酸銀標準溶液的體積，mL；c 為硝酸銀標準溶液的濃度，mol/L；NaCl 的摩爾質量為0.058 44,kg/mol；m 為樣品的質量，g.

1.2.5 SDS-PAGE 電泳的測定

A 液(丙烯酰胺儲存液)：稱取29.2,g 丙烯酰胺和0.8,g 雙丙烯酰胺，加蒸餾水至100,mL，4,℃冰箱保存.

B 液(4#分離膠緩沖液)：將75,mL 2,mol/L 的Tris-HCl(pH 8.8)、4,mL 10% SDS、21,mL 蒸餾水混勻，4,℃冰箱保存.

C 液(4#濃縮膠緩沖液)：將50,mL 1,mol/L 的Tris-HCl(pH 6.8)、4,mL 10% SDS、46,mL 蒸餾水混勻，4,℃冰箱保存.

電泳緩沖液：稱取3,g Tris、14.4,g 甘氨酸、1,g SDS，加蒸餾水至1,L.

上樣緩沖液：含有 2,mL 0.5,mol/L Tris-HCl(pH,6.8)，2,mL 甘油，2,mL 10% SDS，0.5,mL 0.1%溴酚藍，1.0,mL 2-β-巰基乙醇，2.5,mL 雙蒸水，室溫保存.

分離膠的配制(15%，20,mL)：10,mL A 液，5,mL B 液，0.1,mL 10%過硫酸銨，10,μL TEMED，0.5,mL蒸餾水，混勻，現用現配.

濃縮膠的配制(5%，8,mL)：1.34,mL A 液，2,mL C 液，60,μL 10%過硫酸銨，10,μL TEMED，4.6,mL 蒸餾水，混勻，現用現配.

染色液：0.2,g 考馬斯亮藍R-250，84,mL 95%乙醇，20,mL 冰乙酸，定容到200,mL 并過濾，室溫保存.

脫色液：乙醇、冰乙酸、蒸餾水的體積比為9∶1∶10.

取0.05,g 樣品，加入100,μL 去離子水，室溫振蕩2,h，10,000,r/min 離心5,min，取上清液備用.取上清液加入上樣緩沖液，煮沸5,min，8,000,r/min 離心5,min.用微量進樣器將處理好的樣品緩慢均勻加入加樣孔中.濃縮膠上所加的電壓是80,V，當染料進入分離膠后，將電壓提高至120,V.電泳結束后，凝膠在固定液中固定1,h，染色5,h 后脫色，直到蛋白質背景干凈，藍色條帶清晰為止.最后用凝膠成像儀進行數據采集并分析[15].

1.2.6 質構分析

質構分析是采用壓縮方式測試食品的觸覺特性.觸覺特性影響到消費者的感官感覺和對食品的接受程度[16].選取探頭類型為P/0.5，測前速度為3.00,mm/s，測中速度為 1.50,mm/s，測后速度為1.50,mm/s，2 次下壓間隔時間為10.00,s，下壓距離為10.00,mm.

測定的質構參數包括硬度、彈性、內聚性、黏性、咀嚼度和回復性，各參數的定義見表2[17].

表2 質構參數的含義Tab.2 Definition of texture parameters

1.2.7 微觀結構觀測

取待測樣品切成薄片，使其表面保持平整，浸泡于2.5%的戊二醛溶液中，置在4,℃條件下固定3,h 以上.然后，用pH,7.2 的磷酸緩沖液清洗3 次，每次保持10,min.分別用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇梯度脫水10,min 左右.再將樣品放置在冷凍干燥器下迅速冷凍，然后進行捶擊，使之自然斷裂，選擇小塊樣品.采用離子濺射方法噴金約5,min，最后置于掃描電鏡下進行觀察[18-19].

2 結果與討論

2.1 感官品質評價

對速熟腐乳進行感官指標的測定，并與市售的利民腐乳和王致和腐乳進行對比，結果見表3.

表3 速熟腐乳與傳統腐乳的感官評價分析比較Tab.3 Sensory evaluation of instant-sufu and traditional sufu

由表3 可以看出：速熟腐乳在色澤、口感和香氣等方面與市售的腐乳沒有顯著差異.

2.2 理化指標分析

將發酵30,d 的速熟腐乳與市售的利民腐乳和王致和腐乳進行比較，3種腐乳的理化指標對比結果見表4.

由表4 可以看出：速熟腐乳的水分含量、總酸含量、氨基酸態氮和蛋白質含量與市售的利民腐乳和王致和腐乳沒有顯著的差異，均符合國家標準；速熟腐乳的NaCl 含量明顯低于市售的兩種腐乳，且略低于國家標準，這更加符合人們對低鹽食品的需求，同時也改變了腐乳只能作為調料品的觀念，其可作為輔餐食用.

表4 速熟腐乳與傳統腐乳的理化指標比較Tab.4 Index comparison of instant-sufu and traditional sufu

2.3 SDS-PAGE電泳分析

分別取白坯、毛坯、后酵10,d，后酵20,d、速熟腐乳(后酵30,d)、利民腐乳、王致和腐乳進行電泳實驗，并采用凝膠呈像系統軟件，通過相對分子質量的對比分析乳酸菌發酵豆乳凝膠樣品中蛋白質的水解情況，結果見圖2.

圖2 樣品的SDS凝膠電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of the sample

由圖2 可以看出：白坯中大豆蛋白主要由7,S 和11,S 球蛋白構成，7,S 主要由α′、α、β 三個亞基構成，相對分子質量分別為76,000、72,000、50,000，而11,S由酸性亞基(相對分子質量為 30,000～40,000)和堿性亞基(相對分子質量在25,000 以下)構成.在乳酸菌發酵豆乳凝膠過程中，隨著發酵時間的延長，大分子質量的蛋白質被水解成小分子質量的胨、肽和氨基酸，球蛋白的水解程度也增加，7,S 和11,S 球蛋白的亞基被水解，表現為條帶變窄，說明出現了大量的小分子質量物質.在11,S 堿性亞基以下的小分子的快速遷移中肽隨時間逐漸增多，最終該新型的速熟腐乳后酵30,d 所得到的腐乳與市售成熟6 月的腐乳出現條帶的寬窄相似，表明速熟腐乳的成熟程度與市售腐乳一致.

2.4 質構分析

利用質構儀對白坯、發酵10,d、發酵20,d 和速熟腐乳(后酵30,d)樣品進行質構參數測定，并與利民腐乳和王致和腐乳進行對比，結果見表5.

由表5 可以看出：速熟腐乳的硬度隨著發酵的延長不斷地變小，與市售的利民腐乳相差不大，但卻明顯高于市售王致和腐乳，這可能是因為在王致和腐乳在制作過程中水分含量較高；速熟腐乳的彈性、黏性、咀嚼度和回復性隨著發酵時間的推后，均呈現小幅度下降的趨勢，且與市售腐乳的指標相差不大，比較適中.

表5 樣品的質構參數測量結果比較Tab.5 Comparison of texture and structure

2.5 微觀結構觀測

對白坯、速熟腐乳(后酵30,d)及市售的腐乳的微觀結構進行電鏡掃描實驗，對比其微觀結構，結果見圖3.

圖3 樣品的微觀結構對比Fig.3 Comparison of the microstructure of the samples

豆漿中由于水化膜和雙電層的存在，使得蛋白質粒子均勻穩定地溶解于水中，而豆腐白坯則是借助乳酸菌產酸和鈣橋的作用使得大豆蛋白相互聯結，形成致密穩定的網絡結構，如圖3(a)所示.由于毛坯的水解作用，腐乳內部大的膠粒狀蛋白質聚集體被降解成小聚集體，隨著后酵時間的增加，蛋白質膠粒逐漸變小，當速熟腐乳的后酵時間達到30,d 時，坯體中膠粒蛋白質消失，蛋白質已經完全被水解，形成平滑均一的形態，如圖3(b)所示.速熟腐乳與市售腐乳對比發現，速熟腐乳的微觀結構與市售6 月的腐乳結構較相似，其形態較市售腐乳平滑均一，說明后酵30,d 的腐乳已達到成熟.

3 結語

本文將經乳酸菌混合發酵劑發酵得到的速熟腐乳與市售兩種腐乳進行了對比.分析表明，在感官指標、電泳分析、質構分析、微觀結構和理化指標中除NaCl 含量外，速熟腐乳與市售的利民腐乳和王致和腐乳間無明顯差異，且符合國家標準.速熟腐乳的發酵生產周期顯著縮短，并且其NaCl 含量明顯低于市售腐乳，可作為輔餐使用，具有較好的開發前景.

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