甘草組培與栽培主要成分的提取及活性比較

滿淑麗，劉延濤，張 咪，郭松波，高文遠

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)的化學成分復雜、藥理作用顯著，臨床常協同其他藥物使用.作為藥用植物，甘草具有免疫調節、抗病毒、抗癌、抗炎、抗過敏、抗潰瘍、抗衰老等多種生物活性作用[1].隨著甘草使用量的不斷加大、資源隨之減少，組培甘草將成為可以解決供應緊張的栽培甘草的替代品.組培甘草的培養周期要短于栽培甘草，并且能產生大量的多糖、黃酮、三萜等有效成分.課題組前期已成功獲得組培甘草[2]，本文旨在研究比較栽培甘草與組培甘草之間提取物含量及抗氧化活性差異，最終探討組培甘草輔助或替代栽培甘草的效果及可行性.

1 材料與方法

1.1 實驗原料

栽培甘草購自天津同仁堂藥店，懸浮培養細胞甘草種子由北京時珍中草藥研究所提供，經天津大學藥物科學與技術學院高文遠教授鑒定為烏拉爾甘草(G.uralensis Fisch)的種子.甘草懸浮細胞采用兩步培養方式培養，具體方法參考文獻[2].

1.2 試劑與儀器

香草醛，天津市元立化工有限公司；蒽酮(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸，天津市福晨化學試劑廠；吐溫40、亞油酸，天津市光復精細化工研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯(DPPH)，Sigma 公司；其余試劑均為分析純.

LAEOROTA 4000 型旋轉蒸發儀，德國Heidolph公司；SHZ-DⅢ型循環水式真空泵，鞏義市于華儀器有限責任公司；酶標儀，基因有限公司；TU-1810 型紫外-可見光分光光度計，北京市普斯通科技有限責任公司；TD6M 型臺式低速離心機，鹽城市凱特儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 甘草水提物(甘草多糖)

取經粗研磨的組培甘草和栽培甘草粉末制成甘草提取液，4,000,r/min 離心 12,min，取上清液于70,℃、60,r/min 旋轉蒸發濃縮.收集所得栽培甘草濃縮液.在4 倍體積的無水乙醇中加入栽培甘草濃縮液，靜置出現絮狀沉淀.經離心處理收集沉淀，干燥后得到甘草粗多糖.

Sevag 法脫蛋白：加入1/4 體積的氯仿-正丁醇(4∶1)溶液劇烈振蕩15,min，靜止分層后棄有機層，離心除水去掉水層和溶劑層交界處的變性蛋白質，重復操作5 次，合并上清液，測量其蛋白質含量和多糖含量.將所得脫蛋白多糖再次醇沉，干燥后得到精制的栽培甘草多糖和組培甘草多糖.

1.3.2 甘草醇提物(黃酮類)

稱取栽培甘草和組培甘草樣品各100,g，用80%,乙醇進行提取，料液比(g∶mL)為1∶20，靜置1,h后，超聲處理30,min，68,℃水浴2,h，冷卻后過濾，對提取過的濾渣用0.5%,的氨性乙醇提取(乙醇60%,)，料液比(g∶mL)為1∶20，靜置12,h 后，68,℃水浴1,h 抽濾，合并3 次提取的濾液，濃縮干燥后得到的甘草浸膏即為實驗所需甘草醇提物.

1.3.3 甘草中各有效部位的含量分析

甘草多糖含量的測定：分別稱取干燥的栽培甘草多糖和組培甘草多糖樣品.參考孟娟[3]的方法，以葡萄糖為標準品，采用硫酸蒽酮法測定多糖含量，做3組平行實驗.

皂苷含量的測定：參考蘭霞等[4]的方法.分別取栽培甘草和組培甘草醇提物各20,mg，加甲醇溶解并定容至10,mL，取組培甘草樣品溶液2,mL、栽培甘草樣品溶液500,μL 水浴揮干，以香草醛-冰醋酸為標準品，采用香草醛-高氯酸比色法測定皂苷含量，測定吸光度，做3 組平行實驗.

總黃酮含量的測定：分別取栽培甘草和組培甘草醇提物各25,mg，加蒸餾水溶解并定容至25,mL，取栽培甘草和組培甘草樣品溶液各1,mL，置于10,mL容量瓶中，參考前期報道[5]方法，測定吸光度，做3 組平行實驗.

1.3.4 甘草的抗氧化活性研究實驗

普魯士蘭法：參考李東海等[6]的方法.分別將栽培甘草和組培甘草的樣品配制成15,mg/mL 的待測樣品溶液，按測定抗壞血酸標準曲線的步驟，在700,nm 處測其吸光度，做3 組平行實驗.

水楊酸比色法：將栽培甘草和組培甘草各配制出0.5、1、2、4、6,mg/mL這5個梯度的樣品溶液.參考袁建梅等[7]的方法，并做適當調整，做3 組平行實驗.

DPPH 清除自由基法：參考張丹參等[8]的方法，并進行適當調整選取合適的樣品濃度.分別吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0,mL 于試管中，并用無水乙醇定容至2,mL.加入1.0,mL DPPH 試劑后，37,℃反應30,min，于517,nm 處測定吸光度.

β-胡蘿卜素褪黑法：參考黃海蘭等[9]的方法，并進行適當的調整.取樣品溶液0.5,mL，加入5,mL 的β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液，以蒸餾水為空白對照組.樣品加入后開始于470,nm 處測量吸光度，此時記為0,min，之后每20,min 測1 次至120,min 結束.期間將反應試管置于50,℃水浴中保溫.

1.3.5 統計學處理

實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS19.0軟件處理，采用 t 檢驗分析數據.

2 結果與討論

2.1 甘草活性成分的含量分析

2.1.1 甘草多糖

本實驗采用栽培甘草和組培甘草粉末分別為150,g 和100,g.經粗提取和精制后多糖質量分別為2.04,g 和5.20,g.

依據硫酸-蒽酮比色法，在585,nm 處測量進行比色，得到樣品的吸光度.結果顯示，組培甘草中分離得到的精制甘草多糖高于栽培甘草，存在顯著性差異(P＜0.05)，它們分別為(21.6±0.1)%,和(19.2±0.2)%,.

2.1.2 甘草皂苷和黃酮含量測定

植物組織培養基技術作為一種高效的生物技術已經在生產很多植物次生代謝產物得到了應用[10].通過測定，組培甘草的總皂苷含量為(7.0±0.2)%,，栽培甘草的總皂苷含量為(45.4±1.1)%,；通過紫外-可見光分光光度計，在400,nm 下測得組培甘草的總黃酮含量為(31.2±1.5)%,，栽培甘草的總黃酮含量為(30.6±1.9)%.

2.2 抗氧化活性實驗

2.2.1 普魯士蘭法

根據抗壞血酸標準曲線得出線性回歸方程為y＝0.003,0,x+0.161,3，相關系數R2＝0.999,2，該方法呈現良好線性關系，測定結果見表1.

表1 栽培甘草和組培甘草中各成分抗氧化活性比較Tab.1 Comparison of the antioxidization activity of each component

由表1 可知，栽培甘草醇提物與組培甘草醇提物當中的還原物質含量相當，不存在顯著性差異.而精制多糖中，組培甘草顯著高于栽培品種.

2.2.2 水楊酸比色法

通過實驗對4 種樣品的氧自由基清除能力進行比較，結果如圖1 所示.在實驗研究的質量濃度范圍內，4 種樣品對氧自由基的清除能力隨質量濃度的增大而上升，且在實驗的質量濃度范圍內，組培甘草醇提物抗氧化能力最強，其次為栽培甘草醇提物，再次為組培甘草多糖，抗氧化能力最弱的為栽培甘草多糖.

圖1 4種樣品對羥基自由基清除率曲線Fig.1 Curves of hydroxyl radical scavenging rate

2.2.3 DPPH 清除自由基法

由圖2 可知，4 種樣品對DPPH 自由基均有明顯清除效果，在較低濃度時，4 種樣品對DPPH 的清除率呈現近似線性關系，栽培甘草多糖與組培甘草黃酮此時清除率較為近似、栽培甘草黃酮與組培甘草黃酮之間的清除率較為近似，甘草中多糖與黃酮的清除率差距較大.

圖2 4種樣品對DPPH的清除率曲線Fig.2 Curves of DPPH scavenging rate

為準確量化對4 種樣品清除DPPH 能力的大小，應用SPSS 軟件計算清除率達到50%,的時候的IC50值(見表1).IC50值越小，則證明該樣品對DPPH清除能力越強，抗氧化能力也越強.

綜上，清除DPPH 的能力為：組培甘草黃酮＞栽培甘草黃酮＞組培甘草多糖＞栽培甘草多糖.

2.2.4 β-胡蘿卜素褪黑素法

圖3 為2,mg/mL 樣品組所測得的抗氧化活性結果.結果顯示抗氧化活性最高的為栽培甘草多糖，其次為栽培甘草黃酮，再次為組培甘草多糖，最弱的是組培甘草黃酮.

為量化比較樣品的抗氧化能力，分別計算出兩個樣品組清除率達到50%,所需時間.2 mg/mL 樣品組結果見表1.

圖3 β-胡蘿卜素褪黑素法抑制曲線Fig.3 Curves of β-carotene melatonin suppression

根據表1 可以看出，總還原力比較中，組培甘草黃酮與栽培甘草黃酮活性相當，組培甘草多糖顯著高于栽培甘草多糖.水楊酸及DPPH 實驗均基于自由基清除原理，通過活性分析發現抗氧化效果較好的是組培甘草黃酮和組培甘草多糖；β-胡蘿卜素-亞油酸模型表明栽培甘草多糖與組培甘草多糖均具有較強的抗氧化活性.由于以上模型的抗氧化機制不同，因此，組培甘草可能主要通過自由基清除和總還原性物質含量較高等發揮抗氧化活性.

3 結論

組培甘草多糖含量顯著高于栽培甘草多糖，而組培甘草皂苷類含量顯著性低于栽培甘草；黃酮類成分兩者含量相當，不存在顯著性差異.因此在開發其活性時更側重于對甘草多糖及黃酮類活性的研究.通過抗氧化活性實驗表明，組培甘草和栽培甘草黃酮活性相當，組培甘草多糖顯著強于栽培甘草多糖.水楊酸及DPPH 實驗均基于自由基清除原理，通過活性分析發現抗氧化效果較好的是組培甘草黃酮和多糖；β-胡蘿卜素亞油酸模型表明栽培甘草和組培甘草多糖均具有較強抗氧化活性.由于以上模型的抗氧化機制不同，因此，組培甘草可能主要通過自由基清除和總還原性物質含量較高等發揮抗氧化活性.總之，組培甘草的各個有效部位均顯示較好的抗氧化活性，因此，研究發現懸浮細胞技術將作為一個新的途徑使輔助或替代栽培甘草成為一種可能.

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