枯草芽孢桿菌發酵大豆過程中水提物的ACE 抑制活性的變化

李風娟，劉婉璐，方元元，趙 月，王昌祿

(食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

高血壓是引發心腦血管疾病的主要風險因素之一，人體的腎素–血管緊張素系統是一種重要的體液調節機制，其中血管緊張素轉換酶(angiotensin I-converting enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)是該系統的一個關鍵酶，它可以通過催化無活性的血管緊張素Ⅰ轉化為具有強血管收縮活性的血管緊張素Ⅱ，并降解具有血管舒張活性的血管舒緩激肽，從而致使血壓升高[1].所以，對ACE 活性的抑制被認為是治療高血壓的一種有效手段.由于化學合成的ACE 抑制劑類降壓藥物存在咳嗽等副作用，具有ACE 抑制活性的食品或食源性成分受到廣泛關注.

目前已發現的食源性ACE 抑制劑大多數為活性肽類物質[2–3]，發酵大豆食品的ACE 抑制活性也與大豆蛋白質被微生物蛋白酶降解所生成的多肽密切相關，如從日本腐乳中分離得到的Trp-Leu 和Ile-Phe-Leu[4]、從高溫快速發酵豆醬中得到的Leu-Val-Gln-Gly-Ser[5]等.另一方面，考察發酵過程中產品的ACE抑制活性的變化，進而有效地控制發酵過程，對于降血壓功能性食品的生產具有重要的應用指導意義.本研究采用一株枯草芽孢桿菌制備發酵大豆，旨在研究發酵過程中ACE 抑制活性的變化規律，并從大豆蛋白質的降解及多肽的生成角度進行分析，以期為應用該菌株研發具有潛在降壓活性的發酵大豆食品提供理論依據.

1 原料與方法

1.1 原料與試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SY 菌種從醬曲中分離得到.大豆購自吉林農科院大豆研究中心.

血管緊張素轉換酶(ACE，0.1,U，源于兔肺)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、鄰苯二甲醛(OPA)、谷胱甘肽和 2，4，6–三硝基苯磺酸(TNBS)購自美國Sigma 公司，酵母提取物和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司，其他試劑均為分析純.

1.2 實驗儀器

EYELA KCL–2000 型恒溫恒濕培養箱，日本東京理化公司；ALPHA 2–4 LD plus 型真空冷凍干燥機，德國Christ 公司；Avanti J–26 XP 型冷凍離心機，美國Beckman Coulter 公司；RF–5300PC 型熒光分光光度計，日本島津公司；Infinite M200 PRO 型酶標儀，瑞士Tecan 公司；Agilent 8453 型紫外-可見分光光度計，美國安捷倫公司.

1.3 樣品的制備方法

1.3.1 發酵大豆的制備

將0.5,g 酵母提取物、1.0,g 胰蛋白胨和1.0,g NaCl 混勻，加100,mL 蒸餾水溶解，用HCl 調pH 至7.0，滅菌20,min，制備LB 液體培養基.

從保藏斜面上挑取枯草芽孢桿菌SY 接于LB 液體培養基(50,mL/250,mL 三角瓶)，于 37,℃、150,r/min 搖床培養12,h，得到種子液，備用.

挑選顆粒飽滿、無蟲害的大豆，清洗干凈，用3倍質量的水在室溫下浸泡過夜，然后將水瀝干后定量盛于竹屜中，于121,℃蒸40,min.蒸制大豆冷卻后接種枯草芽孢桿菌SY 種子懸浮液，接種量為1,mL/100,g，攪拌均勻，移入恒溫恒濕培養箱，于37,℃、相對濕度90%的條件下進行培養，并定時取樣.

1.3.2 發酵大豆水提物的制備

將上述各發酵階段所獲取的發酵大豆樣品置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥，磨碎.準確稱取0.5,g凍干粉，加入5,mL 蒸餾水，充分振蕩混勻.超聲波提取 5,min 后于室溫下搖床提取 1,h，再沸水浴15,min.將所得樣液6,500,r/min 離心10,min，上清液以0.45,μm 膜過濾，收集濾液，即為樣品水提物，將其濃度標記為100,mg/mL.

1.4 ACE抑制活性的測定

對ACE 抑制活性的測定參照Li 等[6]的評價方法.將樣品水提物適當稀釋，以96 孔酶標板作為反應容器.將15,μL 樣液(對照反應液中以蒸餾水代替)與30,μL 4.66,mmol/L 的HHL 溶液(溶于0.6,mol/L NaCl–0.4,mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 8.5)混合，然后加入30,μL 12.5,mU/mL 的ACE 酶液(樣品反應液和對照反應液的空白以蒸餾水代替)，在微孔板混合器上混勻后于 37,℃反應 1,h.加入 120,μL 1.2,mol/L NaOH 溶液終止酶反應，接著加入30,μL 2%的OPA溶液(溶于甲醇)，混勻，室溫下靜置20,min 后加入30,μL 6,mol/L 的HCl 溶液終止衍生反應.將反應液稀釋30 倍后測定熒光吸收強度，條件如下：激發波長340,nm，發射波長455,nm，狹縫寬度5,nm.樣液的ACE 抑制率計算公式為

式中：I1表示樣品反應液即存在ACE 抑制劑時的熒光吸收強度；I2表示對照反應液即無ACE 抑制劑時的熒光吸收強度.

ACE 抑制率越大，說明抑制劑在該濃度條件下抑制ACE 活性的能力越強.以抑制劑濃度的對數值為橫坐標，以抑制率為縱坐標，繪制回歸曲線，抑制率為50%時抑制劑的濃度即為半抑制濃度(IC50)，IC50越小，說明抑制劑對ACE 活性的抑制能力越強.

1.5 中性蛋白酶活性的測定

稱取1.0,g 樣品加入10,mL 蒸餾水，在150,r/min振蕩提取1,h 后，于4,℃、6,500,r/min 離心10,min，轉移上清液.在殘渣中加入10,mL 蒸餾水，混勻后再次離心.將兩次離心上清液合并作為酶提取液.

中性蛋白酶活性的測定參照 Yang 等[7]的方法.先取1,mL 酶液與1,mL 2%的酪蛋白溶液(溶于0.2,mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH,7.5)分別于40,℃保溫，10,min 后將兩者混合，再在40,℃精確反應30,min，然后加入2,mL 0.4,mol/L 三氯乙酸(TCA)溶液終止反應，6,500,r/min 離心10,min，過濾.另取1,mL 酶液，先加入TCA 溶液，然后加入酪蛋白溶液，于室溫下6,500,r/min 離心10,min，過濾，濾液作為空白，于275,nm 測定濾液的吸光度.以吸光度為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算出當吸光度為1 時酪氨酸的質量(μg)，即為吸光常數K 值.將上述條件下1,mL 酶液在1,min 內釋放出相當于1,μg 酪氨酸的酶活定義為1 個酶活單位.

1.6 多肽含量的測定

多肽含量的測定參照Church 等[8]的方法.OPA試劑的配制如下：將50,mL 0.1,mol/L 的四硼酸鈉溶液、5,mL 20%的SDS 溶液、0.5,mL β–巰基乙醇及2.5,mL 5%的OPA 溶液(溶于甲醇)混合后，用蒸餾水定容至100,mL.將樣品水提物適當稀釋，取15,μL 置于酶標板小孔中，加入300,μL OPA 試劑，混勻，室溫下靜置反應10,min，用酶標儀于340,nm 測定吸光度.以谷胱甘肽作標準曲線.

1.7 游離氨基含量的測定

游離氨基含量的測定參照 Haynes 等[9]的方法.將樣品水提物適當稀釋，取0.2,mL，加入1,mL 0.212,5,mol/L 磷酸緩沖液(pH 8.2)，然后按一定時間間隔依次加入1.0,mL 0.1%的TNBS 溶液(對照組為蒸餾水)，50,℃水浴中避光反應1,h.按相同時間間隔依次加入4,mL 0.1,mol/L 的HCl 溶液.靜置30,min后取300,μL 置于酶標板小孔中，用酶標儀于340,nm處測定反應液的吸光度.以亮氨酸作標準曲線.

2 結果與討論

2.1 發酵過程中樣品的ACE抑制活性的變化

發酵過程中樣品的ACE 抑制活性的變化如圖1所示(ND 表示未檢測出ACE 抑制活性)，所測樣品的質量濃度為0.667,mg/mL.在該濃度條件下，未發酵的樣品沒有表現出ACE 抑制活性，發酵12,h 的樣品的ACE 抑制率達到70%，而發酵24,h 樣品的ACE抑制率降至44%，在隨后的發酵期間保持平穩.圖2為發酵12,h 的樣品在不同濃度下的ACE 抑制活性，呈現濃度依賴型，根據擬合曲線得到其IC50值為0.312,mg/mL.

在發酵初期樣品中ACE 抑制劑大量快速生成，這也是所用枯草芽孢桿菌快速增殖的過程，而隨著發酵的充分進行，已生成的ACE 抑制劑被最大程度地消耗或轉變，導致活性降低并趨于穩定.在Zhang等[10]的研究中指出，用埃及曲霉(Aspergillus egypticus)發酵制備豆豉時，在15,d 的發酵過程中，樣品的ACE 抑制活性先快速后持續緩慢增加；而用五通橋毛霉(Mucor wutungkiao)發酵制備豆豉[11]及用雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)發酵制備腐乳[12]時發現，樣品的ACE 抑制活性均呈現出初期升高而后降低的趨勢，與本研究的結果相似.據此推斷，對于這些不同類型的發酵大豆食品，其制備過程中ACE 抑制活性的變化會受到發酵原料及發酵菌種等的影響，而對于本研究所用的枯草芽孢桿菌SY 而言，為保持發酵大豆良好的ACE 抑制活性，應嚴格控制發酵進程.同時，這些研究[10–12]均指出多肽類物質對樣品的ACE 抑制活性起著重要的作用，所以本研究也將重點從枯草芽孢桿菌SY 發酵大豆過程中蛋白質降解的角度對樣品的ACE 抑制活性的變化進行分析.

圖1 發酵過程中樣品的ACE抑制活性的變化Fig.1 Changes of ACE inhibitory activity during fermentation

圖2 發酵12 h的樣品在不同濃度下的ACE抑制活性Fig.2 ACE inhibition versus concentration of the sample fermented 12 h

2.2 發酵過程中樣品的中性蛋白酶活性的變化

發酵過程中樣品的中性蛋白酶活性的變化見圖3(ND 表示未檢測出中性蛋白酶活性).發酵12,h 時枯草芽孢桿菌SY 分泌的中性蛋白酶活力(以干質量計)為294,U/g，36,h 時增至718,U/g，在隨后的發酵期間變化不大.

圖3 發酵過程中樣品的中性蛋白酶活性的變化Fig.3 Changes of neutral protease activity during fermentation

發酵大豆食品的ACE 抑制活性多歸因于蛋白質被微生物蛋白酶降解所產生的多肽類物質[4–5]，枯草芽孢桿菌SY 增殖過程中分泌的蛋白酶作用于大豆蛋白質使其降解為小分子多肽.在前36,h，蛋白酶活力持續增加，然而，樣品的ACE 抑制活性已在此階段由高值逐漸降低，說明蛋白質的適度降解對于產品保持較高的ACE 抑制活性具有積極的影響，而發酵后期蛋白質或多肽發生的進一步降解則會造成ACE抑制活性的損失.

2.3 發酵過程中樣品的多肽及游離氨基含量的變化

發酵過程中樣品的多肽及游離氨基含量的變化分別見圖4 和圖5.由此可見兩者具有相似的變化趨勢，至發酵48,h，多肽含量(以干質量計)持續升高至30.57,g/100,g，至發酵72,h，游離氨基含量(以干質量計)持續增至1.00,mmol/g，然后逐漸趨于穩定.結合中性蛋白酶活性的變化可以看出，在高活力的蛋白酶的作用下，大豆蛋白質逐漸被充分降解，這進一步說明了樣品ACE 抑制活性的損失與蛋白質的過度降解有關.Chiang 等[13]在研究中用5 種不同的蛋白酶直接作用于大豆分離蛋白，發現用風味蛋白酶所得酶解物的水解度最高卻表現出最低的ACE 抑制活性，指出了高蛋白水解程度不一定保證高ACE 抑制活性.

圖4 發酵過程中樣品的多肽含量的變化Fig.4 Changes of peptide content during fermentation

圖5 發酵過程中樣品的游離氨基含量的變化Fig.5 Changes of amount of free amino groups during fermentation

多肽與ACE 的結合能力取決于其結構特點，在發酵初期所生成的多肽的結構更有利于其與ACE 的活性位點結合進而發揮抑制作用，而隨著發酵的進行，這些有利的結構特點可能隨著多肽的進一步降解被逐漸打破，降低了其與ACE 活性位點的有效結合而減弱了對ACE 的抑制作用，從而導致樣品整體ACE 抑制活性的下降.這種變化也同樣發生在用M.,wutungkiao 發酵制備豆豉[11]及用A.elegans 發酵制備腐乳[12]的后酵過程中，樣品中的多肽含量逐漸增加，而ACE 抑制活性卻出現損失.所以，為獲得具有良好ACE 抑制活性的產品，控制蛋白質的適度降解具有重要的意義.

3 結論

采用枯草芽孢桿菌SY 發酵大豆的過程中，樣品的ACE 抑制活性在前期迅速增加，然后降低并保持平穩，發酵12,h 樣品在質量濃度為0.667,mg/mL 時的ACE 抑制率為70%，其IC50值為0.312,mg/mL.中性蛋白酶活力在前36,h 迅速增加達到718,U/g，多肽及游離氨基的含量也逐漸增加并趨于穩定.蛋白質的適度降解有利于高ACE 抑制活性多肽的生成，而過度降解則造成產品活性的損失.在控制發酵進程的條件下，枯草芽孢桿菌SY 有望應用于發酵大豆食品的生產而獲得具有潛在調節血壓作用的產品，同時，還需對產品中的ACE 抑制肽進行結構及構效關系的深入分析.

［1］Ondetti M A，Cushman D W.Inhibition of the reninangiotensin system.A new approach to the therapy of hypertension[J].Journal of Medicinal Chemistry，1981，24(4)：355–361.

［2］Miguel M，Contreras M M，Recio I，et al.ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate[J].Food Chemistry，2009，112(1)：211–214.

［3］Quist E E，Phillips R D，Saalia F K.Angiotensin converting enzyme inhibitory activity of proteolytic digests of peanut(Arachis hypogaea L.)flour[J].LWT-Food Science and Technology，2009，42(3)：694–699.

［4］Kuba M，Tanaka K，Tawata S，et al.Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides isolated from tofuyo fermented soybean food[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2003，67(6)：1278–1283.

［5］Rho S J，Lee J S，Chung Y I，et al.Purification and identification of an angiotensin Ι-converting enzyme inhibitory peptide from fermented soybean extract[J].Process Biochemistry，2009，44(4)：490–493.

［6］Li F J，Yin L J，Lu X，et al.Changes in angiotensin Iconverting enzyme inhibitory activities during the ripening of douchi(a Chinese traditional soybean product)fermented by various starter cultures[J].International Journal of Food Properties，2010，13(3)：512–524.

［7］Yang J K，Shih I L，Tzeng Y M，et al.Production and purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes[J].Enzyme and Microbial Technology，2000，26(5)：406–413.

［8］Church F C，Swaisgood H E，Porter D H，et al.Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins[J].Journal of Dairy Science，1983，66(6)：1219–1227.

［9］Haynes R，Osuga D T，Feeney R E.Modification of amino groups in inhibitors of proteolytic Enzymes[J].Biochemistry，1967，6：541–547.

［10］Zhang J H，Eizo T，Ding C H，et al.Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides in douchi，a Chinese traditional fermented soybean product[J].Food Chemistry，2006，98(3)：551–557.

［11］Wang H，Li Y，Cheng Y，et al.Effect of the Maillard reaction on angiotensin I-converting enzyme(ACE)-inhibitory activity of douchi during fermentation[J].Food and Bioprocess Technology，2011，6(1)：297–301.

［12］Ma Y，Cheng Y，Yin L，et al.Effects of processing and NaCl on angiotension I-converting enzyme inhibitory activity and γ-aminobutyric acid content during sufu manufacturing[J].Food and Bioprocess Technology，2013，6(7)：1782–1789.

［13］Chiang W D，Tsou M J，Tsai Z Y，et al.Angiotensin Iconverting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor[J].Food Chemistry，2006，98(4)：725–732.