不同通氣攪拌條件下體外培養(yǎng)CHO細胞高表達西妥昔單抗的研究

翁志兵， 邵春花， 胡 輝

（1．上海中信國健藥業(yè)股份有限公司，上海市，201203；2.抗體藥物國家工程研究中心，上海市201203）

不同通氣攪拌條件下體外培養(yǎng)CHO細胞高表達西妥昔單抗的研究

翁志兵1， 邵春花1， 胡 輝*2

（1．上海中信國健藥業(yè)股份有限公司，上海市，201203；2.抗體藥物國家工程研究中心，上海市201203）

以穩(wěn)定表達西妥昔單抗的CHO細胞為研究對象，采用無血清懸浮培養(yǎng)方式，建立4種不同的通氣及攪拌方式，通過對細胞密度、細胞活率以及蛋白濃度進行跟蹤檢測，考察其對細胞生長和蛋白表達水平的影響。實驗結(jié)果表明新型通氣攪拌方式的細胞密度和蛋白表達量優(yōu)于或相當(dāng)于傳統(tǒng)的微泡通氣方式，同時還改善了細胞培養(yǎng)的微環(huán)境，且在清洗驗證上具有很大優(yōu)勢，為大泡通氣在動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用方面奠定了一定的基礎(chǔ)，也為優(yōu)化中試規(guī)模制備西妥昔的CHO細胞培養(yǎng)工藝奠定了基礎(chǔ)。

西妥昔單抗；CHO細胞；細胞培養(yǎng)；大泡通氣

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)是當(dāng)前生產(chǎn)高附加值抗體類醫(yī)藥產(chǎn)品的基礎(chǔ)。然而動物細胞培養(yǎng)時由于缺乏細胞壁的保護，自身非常脆弱，對剪切力極端敏感。除了攪拌外，通氣帶來的氣泡在破裂的時候，也能產(chǎn)生很大的剪切力，可把細胞擊傷甚至擊碎，影響細胞密度和細胞存活率，乃至過早地觸發(fā)細胞凋亡，從而影響目的蛋白的表達[1-2]。但是動物細胞的生長需要氧氣等外源氣體來維持，細胞培養(yǎng)過程中的通氣是不可避免的，因此通氣方式的選擇就顯得非常重要。

常見的通氣方式分為兩種：一種為無泡通氣，另外一種為有泡通氣，有泡通氣又包括微泡和大泡通氣。其中無泡通氣方式最有利于動物細胞的培養(yǎng)，但是有三大弊端，一是傳質(zhì)效率低，二是CO2難以逸出，三是難以清洗驗證。而采用微泡方式，雖然氧氣傳質(zhì)效率會有所提高，但在規(guī)模化之后，微泡的弊端也逐漸顯現(xiàn)。每次使用后，需要拆卸清洗，微孔通氣裝置為金屬燒結(jié)，很難清潔，使用時間過長后，還會產(chǎn)生銹斑，對GMP檢查也不利[3-6]。若能尋找出一個折中的方案，既能對細胞傷害最小，又能保證使用效率，將有效地提高生產(chǎn)力和產(chǎn)品的安全性。大泡通氣主要用于微生物發(fā)酵，鮮見于哺乳動物細胞培養(yǎng)，借鑒了微生物發(fā)酵經(jīng)驗，大膽嘗試大泡通氣方式，采用六葉平槳和60°平槳組合。大泡通氣具有以下優(yōu)勢：1.大泡通氣設(shè)計簡單，混合傳質(zhì)效果較好，而且易于工藝放大；2.大泡通氣的采用，還可以取代底部CIP噴淋球，可保持罐體密閉的情況下，直接進行CIP，杜絕更換空氣分布器的操作，降低生物污染的機會。目前國際上很多大公司在罐體設(shè)計時，已經(jīng)開始采用大泡通氣方式，而在國內(nèi)尚無發(fā)現(xiàn)采用大泡通氣方式的文獻報道。大泡通氣作為CHO細胞培養(yǎng)通氣方式的一種，具有良好的發(fā)展前景[7-11]。

作者考察不同通氣方式對CHO細胞生長、蛋白表達水平等的影響，通過試驗考察新型通氣方式和傳統(tǒng)通氣方式，即大泡通氣相對無泡、微泡通氣是否具有優(yōu)勢，具有實際應(yīng)用的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

高表達單克隆抗體（西妥昔）的CHO細胞株：作者所在公司提供。培養(yǎng)基：抗體藥物國家工程研究中心提供。

1.2 細胞培養(yǎng)方法

將細胞以1×106cells/mL的初始細胞密度接種于5 L生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)初始體積為3 L，pH控制為6.95，溫度為37℃，溶氧控制為40%的飽和空氣，轉(zhuǎn)速為120 r/min。每天取樣計數(shù)，并將培養(yǎng)液于10 000 r/min離心5 min，保存上清于-20℃冰箱，用于理化參數(shù)分析。

1.3 分析方法

1.3.1 細胞計數(shù)每天取樣利用臺盼藍拒染法染色，使用Countstar自動細胞計數(shù)儀讀取活細胞密度和細胞活率，每樣計數(shù)3次，取平均值。

1.3.2 蛋白表達量檢測HPLC法，色譜柱采用AB公司POROS○RA20 Columns，2.1 mm×30 mm，系統(tǒng)采用Agilent1260 HPLC。流動相A（50 mmol/L PB，0.1 mol/L NaCl），流動相B（體積分數(shù)0.1%HCl，0.1 mol/L NaCl）；體積流量1 mL/min；檢測波長280 nm；進樣溫度（5±3）℃；柱溫（25±5）℃；進樣量100 μL。

1.3.3 氧傳遞系數(shù)（KLa）的測定方法KLa的測定采用動態(tài)法結(jié)合圖解法求值。

1.3.4 葡萄糖-乳酸測定方法采用全自動德國Labo公司TRACE葡萄糖-乳酸分析儀檢測乳酸和葡萄糖濃度，每一樣品重復(fù)檢測一次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同通氣方式對細胞密度和細胞活率的影響

對于CHO細胞培養(yǎng)來說，由于動物細胞無細胞壁，耐剪切力較差，采用不同的通氣方式和攪拌方式會對混合傳質(zhì)造成較大的影響。作者采用4種通氣方式，第一種為無泡通氣，雙層兩葉60°平槳；第二種為微泡通氣，雙層兩葉60°平槳；第三種為大泡通氣，雙層兩葉60°平槳；第四種為大泡通氣，上層為兩葉60°平槳，下層為六葉平槳。作者通過同批次的種子液接種，其他條件溫度、DO、補料等條件均保持一致，采用4種不同的通氣方式來培養(yǎng)CHO細胞，觀察不同通氣條件對細胞生長和蛋白表達量的影響。從圖1可以看出，采用無泡通氣時活細胞密度最高，大泡通氣次之，而大泡通氣方式中，大泡方案2的活細胞密度最高，達到13.2×106cells/mL，尤其是在對數(shù)生長期間細胞生長繁殖迅速，應(yīng)該是由于大泡通氣的氣液混合傳質(zhì)較好，有利于CHO細胞的生長，同時由于剪切力相對較大，對CHO細胞具有一定的損傷，會影響活細胞密度和細胞存活率，因此活細胞密度會低于無泡通氣。

圖1 不同通氣方式對活細胞密度的影響Fig.1 Effect of different ventilation conditions on the cell density of CHO

根據(jù)圖2可以看出，無泡通氣的細胞活率最高，大泡方案2的細胞活率次之，微泡通氣時的細胞活率最低，但是并無較大差異。剪切力較大會造成細胞死亡、非致命的生理反應(yīng)、抗體糖基化水平低等影響，大泡通氣、微泡通氣的細胞活率較低應(yīng)該是由于通氣時的氣泡破裂帶來的剪切力對細胞造成了損傷。研究結(jié)果表明氣液交界面氣泡破裂是造成細胞損傷的剪切力的主要來源，而與大氣泡相比，小氣泡對細胞造成的損傷更大[12]，因此微泡通氣的細胞活率最低，但整體看來4種通氣方式的細胞活率并無較大的差異，都維持在94%以上。

圖2 不同通氣方式下細胞活率的曲線圖Fig.2 Effect of different ventilation conditions on the cell viability of CHO

2.2 不同通氣方式對pH的影響

根據(jù)圖3可以看出，前期由于控制pH，pH基本都維持在6.95，中后期pH不斷上升，4種通氣方式的最終pH相差并不大，其中大泡方案2的pH最高，無泡的pH最低，大泡的pH相對較高的原因可能是采用大泡方案2通氣方式時，混合傳質(zhì)較好，較多的通氣量使溶解在培養(yǎng)液中的CO2隨著氣泡排出，這對于CHO細胞的生長是有利的，高濃度的CO2分壓會影響CHO細胞的生長、代謝和產(chǎn)物的糖基化作用。無泡通氣時的模式使溶解在培養(yǎng)液中的CO2不易排出，這會降低培養(yǎng)液pH，另外乳酸濃度變化也會對pH造成不小的影響，乳酸濃度偏高也會造成pH相對較低。

圖3 不同通氣方式下對pH的影響Fig.3 Effect of different ventilation conditions on the pH

2.3 不同通氣方式對乳酸的影響

根據(jù)圖4可以看出，大泡通氣時乳酸的濃度呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，而采用無泡、微泡通氣時，乳酸濃度呈現(xiàn)逐步上升的趨勢。乳酸是細胞培養(yǎng)的主要副產(chǎn)物，乳酸主要是由于葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑不完全氧化形成的，也可以由其他糖類及其谷氨酰胺產(chǎn)生。乳酸濃度較高時會降低培養(yǎng)液的pH、增大滲透壓，這會抑制細胞的生長，也不利于蛋白的表達。

圖4 不同通氣方式下乳酸pH值的曲線圖Fig.4 Effect of different ventilation conditions on the lactate concentration

2.4 不同通氣方式對KLa的影響

根據(jù)圖6可以看出，不同通氣方式下反應(yīng)器的KLa各不相同，微泡的KLa是最高，大泡方案2的KLa次之，無泡通氣的KLa最低。微泡通氣效率高，KLa高，但相對于大泡而言對細胞的損傷較大，因此細胞密度和細胞活率均略低于大泡通氣。而大泡通氣2的KLa僅低于微泡通氣，供氧能力也滿足要求，通氣量相對較多，混合傳質(zhì)較好，利于培養(yǎng)液氣液相之間的氣體交換，從而有利于培養(yǎng)液中CO2的逸出[13]，對于CHO細胞的培養(yǎng)起到了促進作用，但由于氣泡破裂對CHO細胞的損傷，也對細胞活率造成一定的影響。

圖5 不同通氣方式下的氧傳遞系數(shù)KLaFig.5 KLa of different ventilation conditions

2.5 不同通氣方式對蛋白表達量的影響

根據(jù)圖6可以看出，4種通氣方式中采用無泡通氣時蛋白表達量是最高的，大泡方案2的蛋白表達量次之，但是大泡方案2的蛋白表達量與無泡通氣的蛋白表達量相比并沒有較明顯的差異。120 h期間無泡通氣時的蛋白表達量明顯高于其他通氣方式，而后期無泡通氣和大泡方案2的蛋白表達量差異很小，這應(yīng)該是由于前期細胞對O2需求較小，大泡、微泡通氣對細胞具有一定的損傷，無泡通氣更具有優(yōu)勢，而中后期由于細胞對O2需求較大，大泡方案2能滿足細胞對O2的需求，而且混合傳質(zhì)較好，并改善了細胞培養(yǎng)的微環(huán)境，因此目的蛋白表達量得到了一定的提高。大泡方案2的活細胞密度較高，在生長期大幅度提高細胞密度和細胞活率，有利于后期目的蛋白的表達，提高目的蛋白的表達量[14]。

圖6 不同通氣方式對蛋白表達量的影響Fig.6 Effect of different ventilation conditions on the protein concentration

3 結(jié)語

在5 L反應(yīng)器中，綜合比較了不同通氣方式對CHO細胞生長和蛋白表達水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無泡通氣系統(tǒng)各方面的條件最佳，大泡通氣效果略次于無泡通氣。通過使用60°平槳和六葉平槳組合，可大幅度降低耗氧量，大幅度增加傳質(zhì)效率，消除大泡通氣的最大瓶頸。另外，根據(jù)大泡通氣的特點，罐的規(guī)模越大，攪拌轉(zhuǎn)速越高，高徑比越大，氣體在液體中的滯留時間越長，越是能體現(xiàn)出大泡通氣的優(yōu)勢。作者由于實驗條件的限制，并未找到最優(yōu)的槳葉，臨時采用剪刀力相對較大的六葉平槳，因此轉(zhuǎn)速設(shè)置較小，若能采用其他更好的槳型，并添加適當(dāng)濃度的剪切保護劑降低剪切力對細胞的損傷，可進一步增大轉(zhuǎn)速，進一步提高混合傳質(zhì)效率，更有利于大泡通氣的實現(xiàn)。

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Study on High Level Expression of Cetuximab in Vitro Culture by Different Ventilationand Stirring Conditions in CHO Cells

WENG Zhibing1， SHAO Chunhua1， HU Hui*2
（1．Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co.ltd.，Shanghai 201203，China；2．National Engineering Research Center of Antibody Medicine，Shanghai 201203，China）

Four different Ventilation and stirring conditions were established，Taking CHO cells expressed Cetuximab as research object and adopting the serum-free mediumand suspension culture，the effect of different Ventilation conditions on cell density、cell viability and protein concentration were contrasted.The results show that compared with traditional Ventilation like micro bubble and no bubble，cell density and protein concentration of big bubble Ventilation was almost the same even better in some respects.The new aeration not only changed the microenvironment of the CHO cells，but also had a great advantage in the cleaning validation.This Study laid a foundation for the application of big bubble ventilation on Large-scale Mammalian Cell Culture，and also laid a foundation for the optimization of CHO culture technology in pilot scale.

cetuximab，CHO cells，cell culture，big bubble ventilation

Q 813.11

A

1673—1689（2015）01—0074—05

2014-05-18

上海市科技人才計劃項目（13XD1422100）；上海市科技支撐計劃項目（12431901402）。

翁志兵（1980—），男，上海人，工學(xué)碩士，工程師，主要從事動物細胞培養(yǎng)研究。E-mail：wengzhb@cpgj-pharm.com

*通信作者：胡 輝（1976—），男，上海人，高級工程師，主要從事抗體藥物開發(fā)研究。E-mailhuhui@china-mab.com