超高壓處理對蛹蟲草汁纖維素酶活性的影響

朱雙杰， 潘 見， 楊俊杰， 周 安，3

（1.合肥工業大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州239012；3.安徽中醫學院 中藥學系，安徽 合肥230038）

超高壓處理對蛹蟲草汁纖維素酶活性的影響

朱雙杰1，2， 潘 見*1， 楊俊杰1， 周 安1，3

（1.合肥工業大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州239012；3.安徽中醫學院 中藥學系，安徽 合肥230038）

為了明確超高壓加工技術對纖維素酶活性的影響，分別研究了壓力、保壓時間、溫度、乙醇體積分數、加壓次數和pH值等對蛹蟲草汁中纖維素酶的羧甲基纖維素酶活性（CMC）和濾紙酶活（FPA）的影響。結果表明，纖維素酶的最適壓力、保壓時間、溫度、乙醇體積分數、pH值和加壓次數分別為：400 MPa、10 min、35℃、30%，pH 4.0~7.0，加壓1次，在最適條件下，CMC酶活比處理前分別提高了82.07%、52.41%、87.22%、54.48%、67.52%和66.67%；FPA酶活比處理前分別提高了97.37%、61.4%、69.4%、61.4%、1.31%和33.91%。因此，利用超高壓處理能有效提高蛹蟲草汁中的纖維素酶活性。

超高壓處理；纖維素酶；蛹蟲草；濾紙酶活性（FPA）；羧甲基纖維素酶活性（CMC）

纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，廣泛的存在于植物的細胞壁中。由于該酶能有效地降解植物細胞壁中的纖維素，促進細胞壁中的多糖和黃酮等活性物質的釋放，因此該酶常用于植物活性物質的提取[1-2]。生產中纖維素酶常用于活性物質的提取，該法簡單易行，但提取率不高，且加入的酶會增加后續處理成本[2]；酶協同超聲法雖然能夠顯著增加活性物質的溶出，但其熱效應會導致熱敏性活性物質的損失。因此，研究如何增強植物本身纖維素酶的活性，對提高植物活性物質的提取率具有重要意義。

超高壓技術為食品冷加工技術，該技術能有效殺滅食品中的微生物[3]，不改變食品的色香、味及營養價值[4]，已被應用于活性物質的提取研究中[5]。已有的研究表明，該技術對酶活性的影響較復雜，取決于壓力、溫度、時間、加壓次數、溶劑的性質、酸度值和處理對象的化學組成等[6]，如100~400 MPa的壓力能鈍化鮮橘汁的果膠甲基酯酶活性（PME）[7]，而300~500 MPa的壓力明顯提高了胡蘿卜PME的活性[8]，杏、草莓和葡萄汁中的PPO在100、400和600 MPa時才會鈍化，而蘋果PPO鈍化程度還取決于pH，且在壓力達到100~700 MPa時才將其鈍化[9-11]。可見，研究超高壓對酶活性影響時，具體問題需要具體分析。

作者首次采用超高壓技術，研究超高壓力、保壓時間、保壓溫度、乙醇體積分數、加壓次數以及pH值對蛹蟲草纖維素酶活性的影響，旨在為蛹蟲草新產品的開發與利用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

鮮蛹蟲草：遼寧丹東蟲草合作社提供，由遼東學院劉曉紅副教授鑒定。3，5-二硝基水楊酸（DNS）（分析純），冰醋酸（分析純）、醋酸鈉（分析純）、葡萄糖（分析純），濾紙（定性）、羧甲基纖維素鈉（試劑級）：國藥集團化學試劑有限公司產品。

高效液相色譜儀：Waters公司產品；高速分散均質機：上海標本模型廠產品；超高壓設備：天津華泰森淼生物工程有限公司產品；離心機：北京醫用離心機廠產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 超高壓處理纖維素酶樣品的制備稱取蛹蟲草10 g，加10 mL一定體積分數的乙醇溶液，并調節pH值到一定值，于4 000 r/min勻漿5 min，漿液用耐高壓聚乙烯塑料袋包裝。采用超高壓單因素實驗條件處理后，于25 mL離心管中，6 000 g離心15 min，取上清液測酶活性。

1.2.2 單因素實驗條件在保壓時間10 min、溫度25℃、乙醇體積分數30%、加壓1次、pH 7.0的條件下，考察壓力對纖維素酶活性的影響；在壓力300 MPa、溫度25℃、乙醇體積分數30%、加壓1次、pH 7.0的條件下，考察保壓時間對纖維素酶活性的影響；在壓力300 MPa、時間10 min、乙醇體積分數30%、加壓1次、pH 7.0的條件下，考察溫度對纖維素酶活性的影響；在壓力300 MPa、時間10 min、溫度25℃、加壓1次、pH為7.0的條件下，考察乙醇體積分數對纖維素酶活性的影響；在壓力300 MPa、時間10 min、溫度25±2℃、乙醇體積分數30%、pH 7.0的條件下，考察加壓次數對纖維素酶活性的影響；在壓力300 MPa、保壓時間10 min、溫度25℃、乙醇濃度30%、加壓1次的條件下，考察溫度對纖維素酶活性的影響。

1.2.3 葡萄糖標準曲線標準曲線以葡萄糖質量濃度 （0、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mg/mL水溶液）為橫坐標，與DNS共熱反應顯色后，測吸光度值為縱坐標，得標準曲線y=2.0666x+0.1362（R2=0.999 1）

1.2.4 纖維素酶FPA酶活性的測定濾紙酶活性（FPA）參考GB/T 23881-2009的方法：吸取1 mL酶液，37℃平衡10 min。Whatman濾紙條（1×6 cm）對稱剪成32片后加入已編號的25 mL具塞的比色管中，用1 mL的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液浸潤濾紙片，37℃平衡10 min。再依次加入 2 mL DNS溶液（空白對照組），0.5 mL酶液，5 mL水。漩渦振動5~ 10 s，37℃水浴60 min，然后與沸水浴5 min，用水定容值5 mL。與540 nm測吸光度。濾紙酶活力（U/ mL）即為酶催化作用下，每分鐘生成1 mol葡萄糖所需的酶量。

1.2.5 纖維素酶CMC酶活性的測定羧甲基纖維素酶活性（CMC）的測定參考NY/T 912-2004的方法：吸取10 mL羧甲基纖維素鈉溶液，37℃平衡10 min；吸取10 mL酶液，37℃平衡10 min。吸取2 mL經過適當稀釋的酶液，加入已編號的25 mL具塞的比色管中，再加2 mL羧甲基纖維素鈉溶液（空白對照組加4 mL DNS溶液），電磁振動3~5 s，37℃水浴30 min，再加入4 mL DNS溶液終止酶解反應。然后與沸水浴5 min，用水定容值5 mL。于540 nm測吸光度。羧甲基纖維素酶活力（U/mL）即為酶催化作用下，每分鐘生成1 mol葡萄糖所需的酶量。

1.2.6 數據處理與分析每組實驗重復3次，實驗結果采用平均值±標準差表示，采用SPSS統計軟件進行顯著性分析，Origin 8.0作圖，Design-Expert 8.0進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 壓力對對蛹蟲草汁纖維素酶活性的影響

圖1為壓力對纖維素酶活性的影響。在300~ 400 MPa，纖維素酶的活性隨著壓力的增加而增大；其中在400 MPa時，酶活性最大，當壓力超過400 MPa時，纖維素酶的活性反而降低，此研究結果與Murao等[12]研究結論一致。Murao等研究發現，纖維素酶的活性隨著壓力的增加而增加，300 MPa酶活力是常壓的1.5倍，400 MPa酶活力最大，是常壓的1.7倍。

壓力增加纖維素酶的活性可能與其活性中心的微環境密切相關，在一定的壓力范圍內，酶分子活性中心的催化基團和結合基團相互靠近并定向，有利于其余底物分子迅速形成過渡態，加速酶促反應。此外，有報道稱低濃度的金屬離子可激活纖維素酶的活性[13]。Salvador等[14]研究證實了這一結論，在緩沖溶液中，壓力對酶活力的影響是先降低（50~ 200 MPa），再升高（20~400 MPa），然后再降低（40~ 675 MPa）。進一步研究發現，纖維素酶的活性與溶液的水活度具正向關性，離子濃度低時水活度高。實驗中隨著壓力的增加，細胞內的細胞器被破壞，原先被隔離的金屬離子釋放出來，增加了溶液的離子濃度，低濃度的離子增加了纖維素酶的活性。當壓力進一步升高時，超高壓力會改變酶活性中心的體積[14]，使酶活性中心的空間變小，影響了底物與進入活性中心，或使活性中心的色氨酸從羧基或咪唑基的附近離開[15]，酶與底物結合力降低，導致酶促反應降低。

2.2 保壓時間對蛹蟲草汁纖維素酶活性的影響

圖2顯示了在壓力300 MPa、溫度25℃、乙醇體積分數30%、加壓1次、pH 7.0的條件下，時間對纖維素酶活性的影響。纖維素酶的CMC酶活在5 min時接近最大值，纖維素酶的FPA酶活在10 min時達到最大，之后隨著保壓時間的延長，CMC酶活和FPA酶活基本穩定。保壓時間增加纖維素酶的活性是因為超高壓力使微纖維鏈間氫鍵結合減弱，吸水力增加，纖維溶脹[16]，細胞壁中的纖維素酶開始溶出，并與溶脹的纖維結合進行酶促反應，5 min后，纖維素酶已基本溶出，酶促反應飽和，因此變化不明顯。FPA酶活在10 min活性最大，這可能與底物的不同有關[17]，隨著保壓時間的延長，溶脹纖維結構變得更加松散，可及區增多，非還原性末端也增多，容易同時被內切酶和外切酶降解[18]。

圖1 壓力對蛹蟲草汁中纖維素酶活性的影響Fig.1 Effect of pressure on cellulase activity in C. militaris juice

圖2 保壓時間對蛹蟲草汁中纖維素酶活性的影響Fig.2 Effect of holding time on cellulase activity in C. militaris juice

2.3 保壓溫度對蛹蟲草汁纖維素酶活性的影響

為了考察超高壓處理時不同溫度對蛹蟲草纖維素酶活性影響的變化規律，在壓力300 MPa、保壓時間10 min、乙醇體積分數30%、pH 7.0、加壓1次條件下，對蛹蟲草汁采用6個水平的溫度（15、25、35、45、55和65℃）與高壓共同處理，結果如圖3所示。在35℃時，纖維素酶的CMC酶活性和FPA酶活性最高，高于35℃時，酶的活性開始迅速降低，在65℃，CMC酶活性和FPA酶活性分別為0.32 U/ mL和0.53 U/mL。

低溫和高溫都會抑制酶的活性，低溫時，酶促反應低；提升溫度會增加酶促反應，但會引起蛋白質的變性，并導致酶的活性降低。本實驗中，溫度高于40℃，酶的活性迅速降低，而張敬輝等[19]研究認為纖維素酶的最適溫度為50℃，這可能是溫度升高引起了蛋白質的變性，超高壓力和乙醇協同作用增強了酶蛋白的變性效果，從而導致酶解活性迅速降低。

圖3 溫度對蛹蟲草中β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3 Effect of tempreature on cellulase activity in C. militaris juice

2.4 加壓次數對蛹蟲草汁纖維素酶活性的影響

為了考察加壓次數對纖維素酶活性的影響，在壓力300 MPa、保壓時間10 min、乙醇體積分數30%、pH 7.0、保壓溫度25℃、對加壓1、2、3、4、5次條件下纖維素酶活性的變化，結果如圖4所示。加壓次數對纖維素酶活性的影響顯著，加壓1次時，纖維素酶的CMC酶活性和FPA酶活性最高，之后隨著加壓次數的增加，纖維素酶的CMC酶活性和FPA酶活性迅速降低，加壓5次時已基本測不出酶的活性。這是因為壓力能改變酶蛋白的分子結構。加壓1次時，促使酶活性中心靠近并定向，活性中心底物濃度相對增加，從而，加速了酶促反應；隨著加壓次數的增加，酶蛋白分子的構象不斷微調，導致酶活性中心的空間不斷減小，結合基團與催化基團過分靠近，且基團間的定向開始偏移，不利于酶蛋白與底物的結合與反應，當加壓到一定次數時，酶蛋白活性中心結構解體，酶的催化活性不可逆地喪失[20]。

圖4 加壓次數對蛹蟲草汁中纖維素酶活性的影響Fig.4 Effect of times of pressure on cellulase activity in C.militaris juice

2.5 乙醇體積分數對蛹蟲草汁纖維素酶活性的影響

乙醇溶液通常作為活性物質的提取溶劑，而乙醇會促使蛋白質變性，因此考察乙醇體積分數對纖維素酶活性的影響是必要的。在壓力300 MPa、保壓時間10 min、pH 7.0、溫度25℃、加壓1次的條件下，考察不同體積分數的乙醇溶液對纖維素酶活性的影響。結果如圖5所示，在乙醇體積分數低于30%的范圍內，纖維素酶的CMC酶活性和FPA酶活性隨著乙醇體積分數的增加而增高，當乙醇體積分數高于30%時，酶活性開始下降。這是因為適當的乙醇濃度可以改變酶蛋白分子的二級結構，使肽鏈α-螺旋增加而無規則卷曲減少，酶蛋白分子構象更有利于與底物接觸并進行催化反應，當乙醇體積分數進一步增加時，引起酶蛋白質構象的改變超過酶分子所能承受的范圍，雖然更有利于酶蛋白與底物的結合，但活力上升的幅度減小[21]。此外，水可以賦予酶一定的柔性，以維持酶的分子構象和催化功能，乙醇作為極性溶劑，當體積分數達到一定值時，可以破壞酶反應必須的水層，從而降低酶的活性[22]。

2.6 pH值對蛹蟲草汁纖維素酶活性的影響

pH值是影響纖維素酶水解纖維素反應速率的重要因素之一。由于纖維素酶蛋白分子上有許多堿性和酸性的氨基酸側鏈基團，因此隨著pH的不同，這些基團解離狀態就會不同，不同解離狀態直接影響著酶的活性中心和催化中心與底物的結合與反應，或者影響酶蛋白的空間構像，從而改變酶的活性。因此在采用纖維素酶協同超高壓提取的過程中，考察一定的壓力下pH值的變化對纖維素酶活性的影響是必要的。結果如圖6所示。纖維素酶在pH 4.0~7.0的范圍內，纖維素酶的CMC酶活性和FPA酶活性是增高的，而當pH大于7.0后，酶的活性迅速降低。與常壓處理相比，纖維素酶的最適pH范圍變寬，可能的因素有：① 由于壓力破壞了細胞的結構，使得細胞內的金屬離子釋放出來，從而提高了酶的活性[13]；②壓力改變了酶蛋白的分子構象，使得酶蛋白更有利于與底物的結合并進行反應[23]；③

圖5 加壓次數對蛹蟲草汁中纖維素酶活性的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on cellulase activity in C.militaris juice

3 結語

纖維素酶存在最適超高壓力、保壓時間、溫度、乙醇體積分數、加壓次數和pH值，高于或低于最適高壓力使纖維素的結構發生改變，暴露了更多的還原性末端，有利于其和酶蛋白結合[18]。在pH過高時，酶的活性下降，這是因為：① 堿性會引起酶蛋白分子空間構象的改變，導致酶蛋白的變性，使其失去催化功能；② 影響酶蛋白分子的解離狀態，不利于酶蛋白與底物的結合[24]。值，纖維素酶的CMC酶活和FPA酶活性均降低。

圖6 PH值對蛹蟲草汁中纖維素酶活性的影響Fig.6 Effect of pH on cellulase activity in C.militaris juice

研究結果表明，采用超高壓技術加工蛹蟲草汁時，選擇合適的加工參數可有效的提高蛹蟲草汁中纖維素酶的活性。

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Effect of Ultrahigh Pressure Processing on the Activities of Cellulose in C.militaris Juice

ZHU Shuangjie1，2， PAN Jian*1， YANG Junjie1， ZHOU An1，3
（1. Institute of Natural Medicine，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China；2. School of Biotechnology and Food Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239012，China；3.Department of Pharmaceutics，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China）

In order to clarify the effects of ultrahigh pressure processing（UHP）on the activities of cellulose，the CMC and FPA enzyme activities of cellulose in C.militaris juice were studied by pressure，holding time，temperature，ethanol concentration，times of pressure and pH.The result showed that the optimal pressure，holding time，temperature，ethanol concentration，times of pressure and pH of the enzyme were 400 MPa，10 min，35℃，30%，pH 4.0-7.0 and pressure for 1 times，respectively.Under the optimum conditions，the CMC enzyme activity were enhanced by 82.07%，52.41%，87.22%，54.48%，67.52%and 66.67%，and the FPA enzyme activity was enhanced by 97.37%，61.4%，69.4%，61.4%，1.31%and 33.91%，respectively.The experiment illustrated that the ultra-high pressure treatment could enhance the activity of cellulose in C.militaris juice.

ultrahigh pressure processing，cellulase activity，Cordyceps militari，enzyme activity（FPA），enzyme activity（CMC）

TS 201.1

A

1673—1689（2015）01—0062—06

2014-05-14

安徽高校省級優秀青年人才基金重點項目（2013SORL094ZD）。

朱雙杰（1978—），男，安徽安慶人，工學博士，講師，主要從事農產品加工與貯藏研究。E-mail：zhushuangjie@163.com

*通信作者：潘 見（1955—），男，安徽六安人，工學博士，教授，主要從事農產品加工與貯藏研究。E-mail：panjian78@sina.cn