新疆核桃根際土壤中解磷菌的分離篩選及鑒定

張晶晶，李建貴，郭藝鵬，韓 超，秦韻婷

（新疆農業(yè)大學 林業(yè)研究所，新疆 烏魯木齊 830052）

新疆核桃根際土壤中解磷菌的分離篩選及鑒定

張晶晶，李建貴，郭藝鵬，韓 超，秦韻婷

（新疆農業(yè)大學 林業(yè)研究所，新疆 烏魯木齊 830052）

為給核桃專用微生物肥的研制提供菌株材料，通過對新疆核桃根際土壤中解磷菌的分離純化，篩選出對核桃樹具有促生作用且能在其根際穩(wěn)定定殖的優(yōu)質高效解磷菌株。從阿克蘇、和田、喀什等新疆核桃主產區(qū)的根際土壤中分離出解磷菌54株，采用溶磷圈初篩法和液體搖瓶復篩法對其解磷能力進行測定，篩選出解磷能力強的菌株14株。經耐利福平誘導后剩余13株，再進行大田定殖試驗，最終篩選出11株解磷菌。經16S rDNA鑒定，得出這11株解磷菌歸屬于5個屬，分別為假單胞菌屬Pseudomonas，葡萄球菌屬Staphylococcus，動性桿菌屬Planomicrobium，微桿菌屬Microbacterium，不動桿菌屬Acinetobacter，其中，假單胞菌屬為優(yōu)勢種群且解磷效果最好。

新疆核桃；解磷菌；篩選；鑒定

磷是農業(yè)生產中的重要限制因素之一，在土壤缺乏磷素的狀態(tài)下，作物的產量將大大降低。土壤中全磷含量一般都比較充足，但植物可吸收的有效磷含量很低[1]，主要是因為對土壤施用大量的磷肥后，這些可溶性磷肥大部分很快會被轉變成植物難以吸收利用的磷酸鹽形式，主要以磷酸鈣為主[2]。研究表明，解磷菌可以將土壤中的難溶態(tài)磷通過溶解或礦化作用轉化為可溶性磷。核桃Juglans regiaL.是世界著名的四大堅果之一，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能[3]，它作為新疆特色林果的主要樹種，同樣面臨著嚴重缺磷的問題。因此，有必要從核桃土壤中篩選出高效的解磷菌株制成生物菌劑，再回接到土壤中以促進植物生長[4]。這樣不僅可以有效地減少化學磷肥的使用，還對提高作物產量具有重要意義。

目前，國內外已有大量關于解磷菌的研究。在國內方面，2006年，Chen等分離得到多株具有解磷能力的細菌，發(fā)現其解磷作用與有機酸的產生和培養(yǎng)基pH值的降低有關[5]。2007年，呂學斌等將分離得到的4株解磷菌株和2株對照菌株進行了解磷效果的對比試驗，結果發(fā)現不同菌株有著不同的磷源偏好，解磷效果差異較大[6]。2008年，呂德國等探討了解磷細菌定殖規(guī)律及其與本溪山櫻地上部和地下部生長發(fā)育的關系，發(fā)現解磷細菌的定殖數量隨外來微生物侵入數量的增多而減少[7]。國外方面，2005年，Chung等從韓國不同農作物根際土壤中分離得到13株解磷細菌，并進行了全細胞脂肪酸甲酯（FAME）和16S rDNA序列分析[8]。2006年，Hameeda等研究發(fā)現，微生物解磷的能力與其產生葡萄糖酸的量有很大關系，解磷能力強，其相應的產生葡萄糖酸的量也多[9]。2008年，Delvasto等從巴西地區(qū)一種含磷量較高的鐵礦石中分離得到4株解磷細菌，并研究了菌株的多樣性、解磷活力及解磷機制[10]。

如今，解磷微生物肥的應用已很廣泛，但對核桃專用解磷菌劑的研究還比較少。筆者從核桃根際土壤中篩選出具有解磷作用且能在根際穩(wěn)定定殖的優(yōu)質菌株，并對其進行鑒定，旨在為核桃專用微生物肥的研制提供菌株材料。

1 試驗區(qū)氣象條件

試驗于2013～2014年在新疆農業(yè)大學實驗室進行，試驗區(qū)設于阿克蘇紅旗坡農場某核桃園（N39°30′～ 41°27′，E79°39′～ 82°01′）。 試驗區(qū)地處歐亞大陸深處，遠離海洋，具有典型的暖溫帶大陸性干旱氣候特征。降水稀少，蒸發(fā)量大，主要靠灌溉水，蓄水量穩(wěn)定。光照充足，熱量豐富，晝夜溫差大，無霜期較長。地面平均溫度12.0～15.1 ℃，年平均降水量為80.4 mm，年平均蒸發(fā)量為1 948 mm，年平均日照時數2 809 h，一般年份最低氣溫－15 ℃左右，極端最低氣溫－21 ℃。

2 材料與方法

2.1 試驗設計

試驗材料為阿克蘇、和田、喀什等地的核桃根際土壤。土樣帶回實驗室后，取根系及黏附其上的土壤用于解磷菌的分離篩選，將篩選好的解磷菌進行抗生素標記后，定殖于試驗區(qū)，并于加入菌劑后的0、10、25、45 d進行根際土壤的回收，再次進行解磷能力測定及菌落計數。最后，將篩選出的優(yōu)質解磷菌進行菌種鑒定。

2.2 試驗方法

對土壤中解有機磷菌和解無機磷菌的分離分別采用的是卵磷脂與磷酸三鈣解磷培養(yǎng)基[11-12]；解磷能力測定采用的是溶磷圈初篩法[13]和液體搖瓶復篩法[14]；定殖能力測定采用的是含利福平肉湯梯度培養(yǎng)法，從而獲得耐利福平350 μg/mL的標記菌株并進行灌根及回收試驗；菌種鑒定采用的是16S rDNA鑒定[15]。

3 結果與分析

3.1 解磷菌的分離

通過對采集的核桃根際土壤進行解磷菌的分離，共得到54株解磷菌株并對其進行了編號，具體編號見表1。

表 1 新疆核桃解磷菌株Table 1 The phosphate-solubilizing bacteria of Xinjiang walnut

3.2 解磷菌的初篩

將分離得到的54株解磷菌進行溶磷圈法試驗，初步選出以下14株解磷效果較好的解磷菌，并重新進行編號。測定其培養(yǎng)1 d和3 d后，在磷灰石板和卵黃板上形成的透明圈和渾濁圈的半徑，如圖1、圖2所示。

從圖1可以看出，除PH-4外，培養(yǎng)1 d后，解無機磷菌在磷灰石板上形成了透明圈，其半徑為1.71～4.02 mm；培養(yǎng)3 d后，各菌株均形成了明顯的透明圈，其半徑為2.15～6.17 mm。其中，PH-6、PH-7、PH-11、PH-12的解無機磷能力相對較高。

從圖2可以看出，培養(yǎng)1 d后，解有機磷菌在卵黃板上均形成渾濁圈，半徑為2.00～7.82 mm；培養(yǎng)3 d后，各菌株均形成了明顯的渾濁圈，其半徑為3.91～11.83 mm。解有機磷效果好的有：PH-1、PH-4、PH-7、PH-8、PH-11。綜合圖1和2可以得出，在初篩中，PH-1、PH-7、PH-8、PH-11的解無機磷和解有機磷效果均較好。

圖1 新疆核桃解磷菌在磷灰石板上形成的透明圈半徑Fig. 1 Transparent circle radii forming on the apatite board of xinjiang walnut phosphate-solubilizing bacteria

圖2 新疆核桃解磷菌在卵黃板上形成的渾濁圈半徑Fig. 2 Turbidity circle radii forming on the yolk board of xinjiang walnut phosphate-solubilizing bacteria

圖3 解無機磷菌液含磷量Fig. 3 Phosphorus contents of inorganic phosphorus solubilizing bacteria solutions

3.3 解磷菌的復篩

將初篩得到的14株解磷菌與CK（加入等量滅活培養(yǎng)液）一起進行液體搖瓶復篩，其發(fā)酵液1、3、6 d后的可溶性磷含量測定結果見圖3和圖4。

從圖3和圖4可以看出，接種后，隨著天數的增加發(fā)酵液中可溶性磷（解有機磷P＋和解無機磷P－）含量也基本上呈增長趨勢，僅有極少數出現下降，如解無機磷中的PH-3、PH-13和解有機磷的PH-2、PH-4在6 d后濃度有所下降，但其含量與CK相比均有所提高，故將其保留。其中解無機磷效果好的有：PH-7、PH-11、PH-12；解有機磷效果好的有：PH-1、PH-8、PH-11、PH-12。綜合以上結果來看，這14株解磷菌均可進行下一步試驗。

圖4 解有機磷菌液含磷量Fig. 4 Phosphorus contents of organic phosphorus solubilizing bacteria solutions

3.4 耐利福平誘導后菌株的解磷能力

將篩選后的14株解磷菌經利福平標記后，再次進行溶磷圈測定，其結果如圖5所示。

圖5 利福平標記后解磷菌的解磷能力Fig. 5 Phosphate-solubilizing ability of phosphate-solubilizing bacteria after inducted by rifampicin resistance

從圖5可以看出，經利福平標記后，PH-7、PH-8、PH-11仍能保持相對較高的解磷能力，但大多數解磷菌的解磷能力變弱，PH-4、PH-10和PH-13甚至喪失了解無機磷能力，PH-6失去了解有機磷能力。其中，PH-10的解有機磷能力又相對較低，將其去除，采用其它13株解磷菌進行下一步試驗。

3.5 解磷菌定殖試驗

3.5.1 解磷菌定殖后菌落計數結果

將利福平標記過的解磷菌培養(yǎng)液經計數達108cfu/mL后，將其稀釋液與CK（設等量滅活的細菌培養(yǎng)基為對照）一起施入核桃根際，并在加入菌劑后的0、10、25、45 d進行根際土壤的回收計數，試驗結果如表2所示。

表 2 定殖后解磷菌菌落計數Table 2 Colony count of phosphate-solubilizing bacteria after colonization cfu/mL

從表2可以看出，施入核桃根際的解磷菌株在定殖過程中數量呈快速下降的趨勢，這主要是由于初始接種量較大，超出了土壤的承載量，隨著時間的推移，接種進去的解磷菌慢慢適應了當地土壤環(huán)境，菌株數量也逐漸穩(wěn)定下來，45 d后保持在107cfu/mL。其中PH-1、PH-7、PH-8、PH-11、PH-12的菌株數量較多，達到2×107cfu/mL以上，說明其具有較強的適應性。

3.5.2 解磷菌定殖后解磷能力測定結果

將定殖45 d后的解磷菌進行回收，純化后進行溶磷圈試驗，所得結果見圖6。

圖6 定殖后解磷菌解磷能力Fig. 6 Phosphate-solubilizing ability of phosphate-solubilizing bacteria after colonization

從圖6可以得出以下結論，篩選出的13株解磷菌在定殖后基本上仍能保持其解磷能力。其中，PH-1、PH-7、PH-8、PH-11、PH-12的解磷效果相對較好；PH-2、PH-4與PH-13失去了解無機磷能力，且PH-2、PH-13的解有機磷能力效果也不好，將其去除，而PH-4的解有機磷能力相對較好，將其保留。故最終篩選出11株解磷能力較好的菌株。

3.6 菌種鑒定

3.6.1 16S rDNA的PCR擴增產物電泳檢測

采用細菌基因組DNA提取試劑盒對核桃解磷菌進行DNA提取后，對其進行PCR擴增，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得電泳圖譜如圖7所示。

圖7 解磷菌16S rDNA 的PCR擴增產物電泳檢測結果Fig. 7 Electrophoresis test results of PCR ampli fi cation products of phosphate-solubilizing bacteria 16S rDNA

從圖7中可以看出擴增出的16S rDNA片段序列長度在1 000～2 000 bp，符合常規(guī)的16S rDNA序列長度。

3.6.2 16S rDNA基因序列分析

將回收的片段送至上海生工生物工程服務有限公司進行測序，共獲得11條DNA序列，采用ClustalX1.8軟件進行拼接，使用NCBI的BLAST功能，與GenBank中已有序列進行比對，結果如表3所示。

經拼接對比鑒定，發(fā)現這11株解磷菌歸屬于 5個 屬。 其 中，PH-1、PH-4、PH-5、PH-7、PH-9、PH-11為 假 單 胞 菌 屬Pseudomonas，PH-6和PH-14為葡萄球菌屬Staphylococcus，PH-3為動性桿菌屬Planomicrobium，PH-8為微桿菌屬Microbacterium，PH-12為不動桿菌屬Acinetobacter。

4 小 結

4.1 新疆核桃解磷菌的分離篩選

從新疆核桃根際土壤中分離出54株解磷菌，采用溶磷圈初篩和液體搖瓶復篩法，選出解磷菌14株。經耐利福平誘導后，淘汰1株。然后將這13株菌株數量在108cfu/mL水平的解磷菌菌劑進行大田定殖45 d后，13株菌株的數量均保持在107cfu/mL水平（對照為106cfu/mL水平），再用溶磷圈法測定其解磷能力，最終篩選出11株解磷效果較好的菌株。

表 3 解磷菌16S rDNA序列BLAST結果Table 3 BLAST results of 16S rDNA sequence in phosphate-solubilizing bacteria

4.2 新疆核桃解磷菌的鑒定

經16S rDNA進行鑒定，得出這11株解磷菌歸屬于5個屬，其中6株菌株屬于假單胞菌屬Pseudomonas，1株為微桿菌屬Microbacterium，1株為不動桿菌屬Acinetobacter，2株為葡萄球菌屬Staphylococcus，1株為動性桿菌屬Planomicrobium。

綜合以上結果得出，假單胞菌屬為解磷菌的優(yōu)勢種群，而且是解磷能力最好的。本試驗再次證實了解磷微生物的資源種類繁多，可供人們的開發(fā)和利用，特別是假單胞菌屬。但是，由于解磷菌的解磷能力具有不穩(wěn)定性，在菌株保存過程中，有些菌株會失去解磷能力。因此，深入研究解磷能力的穩(wěn)定性和解磷機制是今后的研究目標。

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Screening and identi fi cation of phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere soil of Xinjiang walnut

ZHANG Jing-jing, LI Jian-gui, GUO Yi-peng, HAN Chao, QIN Yun-ting
(Institute of Forestry, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China)

In order to provide strain material for development of speci fi c walnut microbial fertilizer, through separation and purification of the phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere soil of Xinjiang walnut, some high quality and efficient phosphate-solubilizing strains were screened, which had growth-promoting effect for walnut tree and could colonize stably in its rhizosphere. 54 strains of phosphate-solubilizing bacteria were isolated from the rhizosphere soil of Aksu, Hotan and Kashgar walnut-producing areas in Xinjiang, ability of its phosphate-solubilizing were measured by using the methods of dissolved phosphorus ring screening and liquid shake fl ask screening, and 14 strains of bacteria with strong phosphate-solubilizing ability were screened out. 13 strains of phosphate-solubilizing bacteria were reserved after inducted by rifampicin resistance, and eventually 11 strains of phosphate-solubilizing bacteria were selected out after the field colonization experiments. The 11 strains of phosphate-solubilizing bacteria were identified by 16S rDNA, they belonged to 5 genera, and they werePseudomonas,Staphylococcus,Planomicrobium,Microbacterium, andAcinetobacter.Among them,Pseudomonaswas the dominant population and its phosphate-solubilizing effect was best.

Xinjiang walnut; phosphate-solubilizing bacteria; screening; identi fi cation

S664.1

A

1003—8981(2015)02—0057—06

2015-01-04

國家林業(yè)公益性項目重大專項課題“新疆紅棗、核桃專用微生物肥料研制與應用示范”(201304701)；新疆自治區(qū)重點學科森林培育。

張晶晶，碩士研究生。

李建貴，教授，博士生導師。E-mail：lijiangui1971@163.com

張晶晶,李建貴,郭藝鵬,等.新疆核桃根際土壤中解磷菌的分離篩選及鑒定[J].經濟林研究,2015,33(2):57－62.

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.010

http: //qks.csuft.edu.cn

[本文編校：聞 麗]